D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

一株产海因酶菌种的筛选与鉴定

通过对土壤中微生物以单一海因类似物作为唯一氮源富集、分离和纯化,利用双层琼脂法筛选获得产海因酶菌株,以基因工程手段提取其DNA,并进行特异性的16S rDNA测序,最终利用Blastn工具将其基因序列与GenBank数据库中的进行序列比对。研究表明:该菌与Bacillus megateriumQM B1551(NC004604)序列相似性达到98%,证明该菌为巨大芽孢杆菌。     

非天然D-型氨基酸生物转化中酶的纯化及其基因序列

D-海因酶 (D- Hydantoinase,HDTase )和 N -氨甲酰基 - D-氨基酸酰胺水解酶 (D- Carbam oylase,DCase )是医药和食品工业上用于生物转化 D-型氨基酸的酶。为了用人工酶替代现用的天然酶转化工艺 ,我们用热变性、硫酸铵分级及 Q - Sepharose、Phenyl- Sepharose、Superose12等多步柱层析 ,从现用菌株 No.2 2 6 2中纯化了 HDTase和 DCase,二酶均达到 SDS- PAGE纯 ,经 N -端序列分析 ,HDTase和 DCase的 N -末端氨基酸序列分别为 :MDKL IKNGTI和 MTRQKIL AF。首先 ,根据酶的 N -末端氨基酸顺序推论并合成了正向多核苷酸简并引物 ,然后按蛋白质数据库资料 ,在比较不同菌株氨基酸残基同源性基础上 ,化学合成了数对反向多核苷酸引物 ,以菌株 No. 2 2 6 2基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增获得了 HDTase的部分基因序列 (～ 70 0 bp )和 DCase的全部基因序列 (912 bp ) ,为使人工酶用于非天然 D-型氨基酸的生物转化奠定了基础。     

D-核糖产生菌抗噬菌体菌株的选育

从D-核糖异常发酵液中分离纯化出一种噬菌体,将其命名为P001。以枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株为出发菌株,经紫外线诱变法选育出1株具有抗性的与出发菌株相当的突变株。对该突变株进行多次传代和D-核糖发酵试验,结果表明,该菌株对噬菌体P001抗性稳定,其发酵产D-核糖能力也没有改变。     

土壤中腈水解酶产生菌的快速筛选

为了从土壤中快速筛选具有腈水解能力的微生物,建立了以苯酚一次氯酸盐比色法(又名Berthelot比色法)检测96孔板反应产物中氨离子浓度为基础的腈水解酶酶活快速分析方法.用该法从土壤样本中筛选获得了9个酶活力较高的菌株.用HPLC方法定量检测9个菌株对对羟基苯甲腈的转化率,证明苯酚-次氯酸盐比色法微孔板分光光度计的测定结果与HPLC结果对应良好,转化率最高为49.9%.经16s rDNA鉴定,菌株分别属于金黄杆菌属、芽胞杆菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属等.     

一株海因酶产生菌形态特征与培养条件

报道了一株假单胞杆菌(Pseudomonas putida Yz-Ⅱ6)的形态特征及产海因酶的发酵条件．结果表明该菌为杆状，菌落圆形光滑，革兰氏染色阴性，单根极生鞭毛．该菌产海因酶最佳发酵条件为起始pH值7.0的YCG培养基，并用0.1％海因诱导，25℃摇床培养20h，酶活力可达到1.3U／mL菌液．     

脂肪酶高产菌株的筛选及酶学特性研究

从富油土壤中分离筛选到40株脂肪酶产生茵,其中060805茵株产脂肪酶的能力较强,根据其形态特征、生理生化鉴定及16s rDNA鉴定,初步鉴定为短波单胞茵.060805茵株发酵产酶需油脂的诱导,同时也依赖Mg2 ,培养基中不添加Mg2 时产酶量很少,微量的Mg2 就能激活茵体产酶.蔗糖等糖类物质不利于060805菌株产脂肪酶.该酶的最适作用温度为35℃,最适pH为6.0;而且在60℃保温60 min酶活基本不损失,在pH 5.0～8.0范围内稳定.     

L-甲硫氨酸高产菌株的紫外线诱变育种

以一株具有M-海因水解酶系统产L-甲硫氨酸(L-Met)的芽孢杆菌MV0073为出发菌株，用含亮氨酸平板定向选育，经过6轮紫外诱变，筛选出系列L-Met高产突变株，其中菌株M604的L-Met产量最高．在相同培养条件下，M604的L-Met产量是出发菌株的3．14倍，且L-Met能以较高含量持续到发酵结束．M604连续传代6次，遗传性状比较稳定．     

M-海因水解酶系统菌株的筛选及发酵条件优化

以M-海因为唯一碳源、氮源筛选出7株具有M-海因水解酶系统活性的菌株,其中一个菌株M003的M-海因水解酶活性较高,能将M-海因转化为L-Met。对其发酵条件及培养基进行了优化,结果表明最适培养基为(g/L):M-海因5,蔗糖10,NH4Cl1,K2HPO43,KH2PO41,MgSO40.5,FeSO40.1,MnSO40.01,37℃,pH7.5,在优化条件下,L-甲硫氨酸产量达到1.1g/L。     

耐酸乳酸菌的筛选及初步鉴定

以自然发酵泡菜汁液为菌源,以不同的pH值作为对照,并利用不同的pH值作为筛选的初步条件,对耐酸乳酸菌进行筛选,然后对筛选出的菌株做定性实验,包括:产生溶钙圈,革兰氏染色阳性,以及接触酶反应呈阴性.在本实验条件下初步筛选出耐酸性强的2株菌株:菌株2,菌株3,同时,对分离出的乳酸菌菌株划线于MRS固体斜面培养基上,于4℃下保存,为进一步研究奠定了良好的基础.     

柯萨奇A组16型对不同细胞的敏感性研究

目的 细胞是进行病毒分离时常被选用的基质,为了分离肠道病毒CVA16型,我们选取了两种细胞,从中筛选出肠道病毒CVA16型的最敏感细胞。方法 将20份样本通过核酸检测确定其中的CVA16型阳性样本,通过对比RD、VERO这两种细胞的分离效果来比较细胞的敏感性。结果 核酸检测20份样本中确定9份样本为CVA16型,9份样本在RD细胞中分离出6株毒株,在VERO细胞中分离出8株毒株。结论 CVA16型对VERO细胞的敏感性高于RD细胞,实验中分离CVA16型应首选VERO细胞。     

Dot—ELISA及其在植物病毒单克隆抗体筛选中的应用

确立了以硝酸纤维素膜(NCM)作固相载体的Dot-ELISA的最适试验程序,并用此技术检测了284个杂交瘤培养上清,筛选出80个分泌抗甜菜花叶病毒(Beet mo(>)ic virus)抗体的上清样品,阳性率达28.17％。用Dot-ELISA测定小鼠抗甜菜花叶病毒多克隆抗体,与常规ELISA比较,结果表明该技术灵敏度较常規ELISA为高,而且具有操作简便、快速、经济以及适于大量样品检测等优点,是杂交瘤筛选的一种比较理想的有效途经。引入亲和素-生物素系统(ABS)后,该技术灵敏度增高了10倍。此外,还在消除非特异性反应方面进行了某些探索。     

黄曲霉毒素产毒菌株的快速筛选法

运用花生察氏培养基、花生葡萄糖硝酸铵培养基、筛选培养基,这三种培养基对从谷物、食品、饲料等环境中分离出的１２株黄曲霉菌株的产毒能力进行了筛选试验．根据黄曲霉毒素在紫外灯下能发出强烈荧光的特点进行试验,筛选出４株黄曲霉毒素产毒菌株．经过菌株产毒培养、毒素的抽提、薄层层析等一系列试验证明,这三种荧光筛选培养基能够对黄曲霉毒素产毒菌株进行快速有效的筛选．     

白腐菌相容菌株的筛选及其混合培养产酶

在纤维素筛选培养基中加入了黄孢原毛平革菌稻草固态发酵的浸提液,并用这种培养基直接从自然环境中筛选了与黄孢原毛平革菌相容的菌株,在PDA和MEA平板上进行了进一步的相容性测试,选择出了生长稳定、可以与黄孢原毛平革菌较好共存的6株真菌.然后,对它们进行了固态发酵产酶的研究.对发酵体系中滤纸酶活(FPA)、木素过氧化物酶(L iP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)活力的测定结果表明,这种筛选出来的菌株组合可以部分增强酶的活性,完善体系中胞外酶的组成,其中编号为F05的菌效果最好,它在混合培养时,体系中的FPA和Lac都得到了加强,比单独培养F05和P.C.时的酶活分别提高了55.5%,24.1%和217%,146%.     

平板影印与AHBA合成酶基因筛选用于安莎类抗生素产生菌的分离

基因筛选是筛选具有抗生素产生潜力微生物的新方法.针对筛选中单菌落分离纯化不仅工作量大,而且耗费时间,采用一种将平板影印技术与PCR扩增技术相结合从土壤中快速获得具有安莎类抗生素产生潜力的放线菌的方法.根据安莎类抗生素合成途径中的3-氨基-5-羟基苯甲酸合成酶(AH BAs)基因的保守性,通过放线菌的培养、影印、AH-BAs基因的PCR扩增,已从33份土样中获得8株AHBAs阳性菌株.结果表明:该方法是一种非常有效的能够快速获得AHBAs基因阳性菌株的方法,并且该方法可扩展用于从土壤中分离其他有价值的抗生素产生菌.     

生姜内生细菌抗MRSA菌株筛选

生姜中含有多种具抗菌作用的内生细菌，其中也有对“超级细菌”耐甲氧西林金色葡萄球菌（Mcthicillin—resistant Staphylococ-otisaureus，MUSA）有拮抗作用的菌株。从生姜中分离纯化得到20株内生细菌，并采用牛津杯法进行抗MRSA菌株筛选。结果表明，通过初筛得到8株对MRSA有较强拮抗作用的菌株，复筛得到2株拮抗作用显著的菌株，其发酵产物对MRSA的相对抑菌率分别达到了79．17％和93．75％，有开发潜力。     

产木聚糖酶海洋微生物的筛选与诱变育种

以自制木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从多个海洋来源样品中一共筛到60株有透明圈且形态各异的菌株,摇瓶发酵结果显示,38株具有产木聚糖酶能力,其中B659菌株产酶能力最高,酶活力为525.3 U·m L-1.结合B659菌株的形态特征和16S r DNA序列分析鉴定该菌株属于Bacillus属.对B659菌株进行紫外诱变,筛选得到酶活提高13.9%且稳定遗传的突变菌株G3-17;对G3-17菌株进一步进行微波诱变得到酶活较G3-17菌株高出11.6%且稳定遗传的突变菌株W1-40.对B659菌株和W1-40突变菌株进行发酵试验,72 h时W1-40菌株的酶活力达到645.2 U·m L-1,比B659菌株(517.9 U·m L-1)提高24.6%.     

土壤中PVA降解菌的分离与筛选

以含PVA的土壤作为菌种来源，PVA为唯一碳源，在相同培养条件下，采用I2-KI及硼酸染色法进行初筛，再通过测定PV A 降解效率的方法进行复筛。初筛得到PV A 降解菌6株，复筛得到4株单一的PV A降解菌A ，C ，E ，F ，降解效率在48％～61％之间。通过对4株PV A降解单菌进行生理生化实验鉴定出A为假单胞菌属，C为球菌属，E为微球菌属，F为链球菌属。     

高产木糖醇酵母菌的筛选鉴定及两级法发酵特性

从300多种土壤样品中进行筛选,最终得到10株可耐受300 g/L木糖的酵母菌株,且其木糖醇转化率超过64.0%.其中酵母菌株SB18在150 g/L木糖下的木糖醇转化率为68.5%,为相同条件下转化率最大的菌株,并经18SrDNA测序鉴定为热带假丝酵母.酶活测定结果显示SB18木糖还原酶主要依赖辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),其酶活性远大于木糖醇脱氢酶活性.对SB18进行两级法发酵条件研究,确定补充氮源为尿素和酵母提取物,接种量为0.5 g/L,转速转换时间为36 h.在此条件下由250 g/L木糖摇瓶发酵252 h得到207.65 g/L木糖醇,转化率为83.1%,达到理论值的91.8%.本研究表明酵母菌SB18在高浓度木糖醇的工业生产中具有很大的应用潜力.