采用比较蛋白质组学方法研究p38β激酶对293T细胞蛋白质表达的影响

采用比较蛋白质组学方法研究了过表达p38信号通路激酶p38β对人类肿瘤细胞293T细胞蛋白质表达的影响,利用双向电泳和质谱技术分离鉴定了13个差异表达蛋白质.这些差异蛋白的分布从细胞质膜到核,其功能涉及核酸、蛋白质、糖脂类分子的转录、合成和成熟,细胞物质跨膜运输,细胞周期调控以及细胞防御等.文献分析并没有发现上述鉴定的差异表达蛋白是p38β激酶现有直接底物的证据,提示其可能为新的p38β激酶相关蛋白.这些结果表明,比较蛋白质组学方法是寻找激酶新靶标的一种有效工具.     

小鼠腹水瘤巨噬细胞对大肠杆菌O157免疫应答的膜蛋白质组学研究

采用膜亚蛋白质组学方法研究小鼠腹水瘤巨噬细胞Raw 264.7对致病性大肠杆菌O157的免疫应答反应,筛选并鉴定到24个差异表达的膜蛋白质.这些膜蛋白质与细胞免疫、细胞周期、细胞发育、细胞骨架、细胞生长等有关.在蛋白质水平上对巨噬细胞与大肠杆菌间的相互作用关系进行了一些探索性研究,为进一步揭示机体对病原反应的作用机制提供理论基础.     

质膜及其微区的蛋白质组学研究进展

质膜蛋白质由于低丰度和强疏水性等特点,给其提取、溶解、分离以及鉴定带来了很大的困难,因此使质膜蛋白质组学研究成为蛋白质组学研究中的难点和热点.以哺乳动物细胞质膜为例,主要从质膜及其微区的富集、溶解、分离、鉴定方法等方面介绍了细胞质膜及微区蛋白质组以及复合物的研究进展.     

双孢蘑菇耐温差异蛋白质组学研究

利用蛋白质组学和荧光定量PCR方法,研究双孢蘑菇(Agaricus bisporus Lange (Imbach))02菌株在常温与高温胁迫下的蛋白质表达差异,发现了6个差异蛋白质点,经NCBI数据库比对分析,表明6个差异蛋白质分别为HSP70家族的HSS1热激蛋白、异柠檬酸裂解酶、细胞色素P450单氧化酶及3个未知蛋白质.这些蛋白质在双孢蘑菇受热胁迫下具有保护自身稳定的功能.     

双向电泳和肽质谱技术分析结核杆菌H37Ra感染巨噬细胞引致的差异表达蛋白

利用双向电泳及质谱技术对感染结核杆菌H37Ra株前后的巨噬细胞U937株的蛋白质组进行分离和比较分析．双向电泳后在分子质量20～200ku，等电点pI3～10范围内分离出1913个不同蛋白质斑点，肉眼可以明显看见4个蛋白质斑点在表达上的差异．对其中分子质量约75ku等电点约9．5的蛋白质斑点酶解后，进行质谱分析，鉴定为分子质量75．4ku、等电点9．52的蛋白DEAD／H Box Polypeptide 18．说明用蛋白质组学研究结核杆菌与巨噬细胞相互作用机理是可行的，所鉴定的蛋白质DEAD／H Box Polypeptide 18可能与巨噬细胞防御系统有关．     

前脑啡肽原和热休克蛋白参与宿主对结核分枝杆菌感染的应答

利用双向电泳比较了由临床分离的结核分枝杆菌感染离体巨噬细胞U937前后的全细胞蛋白组表达差异，肽指纹鉴定和生物信息学分析2个表达明显上调的斑点．确定它们分别为热休克蛋白HSP105β和前脑啡肽原．比较蛋白质组学和转录组学研究发现，热休克蛋白表达提高可能源于转录增加．提出了从神经免疫学角度研究结核分枝杆菌致病和宿主免疫机理的新思路，为解释吸毒人群中结核病高发病率提供了基础。     

基于双向电泳技术的丙酮丁醇梭菌ATCC824不同产物阶段膜蛋白质组比较

建立丙酮丁醇梭菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白质组;并进行比较分析。研究采用差速离心法提取了该菌在产酸阶段和产有机溶剂阶段的膜蛋白,进行双向电泳分离后,对差异蛋白进行质谱分析。不同生长阶段膜蛋白质组存在明显差异,经质谱鉴定发现9个差异蛋白质,其中3个在产酸阶段高表达,6个在产有机溶剂阶段高表达。生物信息学分析表明,大部分蛋白含有明确的膜定位信息。产酸阶段高表达蛋白多与细胞信号转导有关,而产有机溶剂阶段高表达蛋白功能分布相对复杂。丙酮丁醇梭菌在不同产物阶段的差异膜蛋白被成功鉴定,它们可能在不同产物阶段的转换和细胞信号转导等过程中起到重要调控作用。     

补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证“方证相关”的蛋白质组学研究

揭示补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证"方证相关"的现代生物学基础,制作高血压病气虚血瘀证细胞模型。用补阳还五汤含药血清干预细胞模型,利用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)技术筛选及鉴定差异表达的蛋白点。并对其进行生物学分析。结果高血压病气虚血瘀证组与健康对照组比较,差异蛋白质点有30个。其中,有16个蛋白上调,14个蛋白质下调。补阳还五汤组与高血压病气虚血瘀证组比较,差异蛋白质点有14个。其中,有9个蛋白上调,5个蛋白质下调。MALDI-TOF-MS/MS鉴定出:高血压病气虚血瘀证组与健康对照组差异蛋白点共有8个蛋白被成功鉴定出来。表达上调的蛋白有肽基脯氨酰异构酶A、肽基脯氨酸顺反异构酶A样1亚型、真核翻译起始因子5A-1 B亚型、微管蛋白beta-2C、CRA_b亚型、3-羟酰辅酶A脱氢酶2型异构体2。表达下调的蛋白有丙酮酸激酶同工酶M1亚型、抑制蛋白-1、抑制蛋白-1 1亚型、补阳还五汤组与高血压病气虚血瘀证组差异蛋白点共有3个蛋白被成功鉴定出来。表达上调的蛋白有丙酮酸激酶CRA_c亚型、热休克蛋白27;表达下调的蛋白有膜联蛋白A1,CRA_b亚型。这些蛋白多与促进或抑制细胞凋亡有关。说明高血压病气虚血瘀证存在着细胞凋亡,补阳还五汤可以纠正高血压病气虚血瘀证引起的细胞凋亡。这些差异蛋白可以作为高血压病气虚血瘀证的标志蛋白或补阳还五汤的作用靶点,抑制细胞凋亡可能是补阳还五汤与高血压病气虚血瘀证"方证相关"的现代生物学基础之一。     

差异蛋白质组学及其应用

蛋白质组学是后基因组研究中最主要的部分,其研究策略有2种:一种是"完全"蛋白质组学,目的是检测一种细胞类型或一种组织内基因组表达的所有蛋白质; 另一种是"差异"蛋白质组学,主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的区别与变化.着重介绍了差异蛋白质组学的特点、研究内容和应用前景,简要介绍了适用于差异蛋白质组学研究的相关技术和近期发展概况.     

成年大鼠急性脊髓全横断损伤后差异表达蛋白的蛋白组学研究

为进一步阐明脊髓损伤(SCI)的修复机制,对SD成年大鼠进行急性全横断损伤,将损伤前后的大鼠脊髓总蛋白质进行固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE),经考马斯亮蓝染色后,借助PDQuest软件从中找出差异表达蛋白质点.应用基质辅助激光解吸电离串联质谱对差异表达的蛋白质点进行鉴定,成功鉴定出38种蛋白质.其中表达上调的蛋白质有电压依赖的阴离子选择通道蛋白1,α-烯醇酶、硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3、生长因子受体结合蛋白2等,表达下调的蛋白质有谷氨酰胺合成酶、14-3-3 epsilon、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、血红蛋白β-1等.鉴定出的差异蛋白多数涉及到神经细胞的增殖、凋亡、应激反应等过程.     

玉米杂交种与亲本苗期根系蛋白差异表达谱分析

尽管杂种优势已经在生产上得到了广泛应用,但是对其形成机理的认识仍然非常有限．为了进一步探讨玉米杂种优势形成的分子机理,以玉米杂交种豫玉22及其亲本综3和87—1苗期根系为材料,采用蛋白质双向电泳和质谱鉴定技术进行了杂交种与亲本之间苗期根系差异蛋白表达谱研究．结果表明,发芽后8d的杂交种在根长、根尖数目、表面积和生物量等根系性状上均具有明显的杂种优势．双向电泳分析结果显示,在所检测到的1118个蛋白点中,有172个（15．38％）在杂交种与亲本的根系中发生了明显的表达变化,包括单亲沉默、杂种特异、杂种偏低亲、杂种偏高亲和中亲表达等5种差异表达类型,其中以单亲沉默所占比例最高．另外,鉴定出了56个差异表达蛋白点,发现其功能涉及转录和翻译、代谢、能量、信号转导、细胞结构、胁迫响应和转座元件等．因此,玉米杂交种与亲本在蛋白丰度上存在明显的差异,并且差异表达蛋白涉及到各个生长发育过程,可能与玉米根系杂种优势表现有关．     

磷脂酰肌醇转移蛋白质家族的研究进展

脂类的单体转移是由一娄蛋白质来执行的，这组蛋白质把脂类结合到疏水腔，从而使脂娄避开了含水环境、其中的这样一组蛋白质是磷脂酰肌醇转移蛋白质家族(PITPs)，能结合磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱，把它们从一个膜区转移到另一膜区．PITPs是在单细胞和多细胞组织中发现的，但在细菌中没有发现．在鼠和人类中，人们发现负责脂类转移的PITP结构域有五个蛋白，按照序列分成两类：类型I PITPs由两个家族成员α，β构成，它们是小蛋白35kDa，有一个PITP结构域，可以普遍表达；类型Ⅱ A PITPs(RdgBαI和Ⅱ)是很大的蛋白质，有另外的结构域，把蛋白质靶向膜，仅能结合脂类，但不能介导转移．类型Ⅱ B PITP(RdgBβ)与类型I在大小(38kDA)上相似，也是普遍表达的．类型Ⅲ PITPs，以secl4P家族为代表，是在酵母和植物中发现的，但是在序列和结构上与类型I和类型Ⅱ PITPs相似．讨论了PITP蛋白是被动转运蛋白辽是调节蛋白，在行使肌醇酯类和膜转换的专门的生物功能时，能否把转运和结合性质偶连起来．     

烟草烟碱转化相关蛋白质筛选分析研究

为了研究烟草中烟碱转化机理,应用比较蛋白组学方法研究了高烟碱烟草中烟碱转化相关蛋白质表达情况.采用双向电泳联用质谱技术比较了实验组高烟碱转化烟草叶片和对照组野生型烟草叶片的蛋白质差异,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了34个差异蛋白质点,采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定,其中在实验组中相对下调的蛋白有7个,相对上调的蛋白有5个.通过比对蛋白质组库数据,发现这些差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢等功能,而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体,表明这些蛋白表达水平与烟碱转化具有密切关系,为研究高烟碱转化率烟叶的形成机理提供了新的依据.     

白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学研究的技术探索

建立白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学技术体系，以患白斑综合征中国对虾的肝胰腺为研究对象，健康中国对虾肝胰腺为对照组,探索2种蛋白质组学差异蛋白的分离和鉴定的方法. 采用双向凝胶电泳(4～7固相pH梯度干胶条，10%SDS-PAGE)分离蛋白质组，银染显色，图像分析软件比较分析，识别差异蛋白，胶上扣点，处理后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF）得到肽质量指纹图谱，软件分析后应用Mascot数据库搜索软件鉴定蛋白. 分别获得中国对虾患白斑病组及对照组正常肝胰腺蛋白质组表达图谱. 分别识别出203和107个蛋白质点. 筛选并尝试鉴定数个差异蛋白. 对各方法步骤进行了技术探讨，对实验过程提出了一系列建议. 建立了双向电泳及生物质谱方法研究中国对虾白斑病的蛋白质组学技术体系. 该体系拓宽了对虾免疫生理研究的途径，以从蛋白质水平探讨对虾发病机制，寻找有效药物靶点.     

肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M鞋细胞蛋白质组表达差异的研究

通过TdR（胸腺嘧啶核苷）调控人肝癌细胞株HepG2的细胞周期，运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M期全细胞蛋白质组表达的差异，探索参与肝癌细胞株HepG2的G1期、G2／M期调控相关的蛋白。以TdR诱导肝癌细胞株HepG2，分别得到同步化的G1期、G2／M期细胞，流式细胞术检测。采用比较蛋白质组学的研究技术（双向电泳、质谱分析）筛选G1期、G2／M期差异表达的蛋白质。结果流式细胞术检测显示TdR诱导后，分别获得（63．62±2．82）％的G2／M期同步化细胞，（75．24±0．17）％的G1期同步化细胞，通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到21个差异表达的蛋白。其中G2／M期表达，G1期未见表达有10种蛋白；存在三倍以上的差异点11个：2种在G2期表达上调，9种在G1期表达上调。说明TdR阻断法能够获得很好的同步化细胞。质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期调控、DNA结合、转录调控、mRNA剪接、肽链合成起始、折叠以及细胞代谢等方面。     

基于LC-MS/MS策略建立十字花科黑腐病菌蛋白质表达谱的方法研究

【目的】建立十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白质。【方法】Xcc 8004经过液体培养,分别提取胞内蛋白质和胞外蛋白质,对所有蛋白质进行液体酶解,通过强阳离子交换色谱预分离多肽混合物,预分离后的馏分采用EASY-nLC结合LTQ-Orbitrap质谱鉴定蛋白质表达谱。【结果】建立了基于bottom-up策略的蛋白质组鉴定方法,采用第一维离子交换预分离和第二维反相色谱分离结合,实现了高通量鉴定蛋白质组表达谱的技术体系。通过SEQUEST检索,在胞内蛋白质样品中共鉴定蛋白质数目为1595个,胞外蛋白质样品共鉴定蛋白质数目为1241个。【结论】建立的LC-MS/MS方法适合用于十字花科黑腐病菌蛋白质组学的研究,为研究微生物植物相互作用奠定了方法与理论基础。     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

牛X与Y精子差异蛋白质组学研究

本研究旨在利用蛋白质组学技术探究牛X、Y精子的差异蛋白质，为X、Y精子免疫分离技术的开发与优化提供一定的理论基础。冷冻保存的安格斯牛X和Y精子样品各三组进行非标定量蛋白质组学研究，共鉴定到1139个蛋白质，其中X精子鉴定到1023个蛋白质，Y精子鉴定到1022个蛋白质。X与Y精子间具有极显著差异(P<0.01)的蛋白质有40个，其中X精子高表达蛋白质7个，Y精子高表达蛋白质33个，Y精子单独鉴定到的蛋白质31个。X与Y精子差异蛋白质集中在代谢过程，大部分具有催化活性，主要位于线粒体内膜；Y精子高表达蛋白质主要参与各类氨基酸代谢及能量物质代谢过程，X精子高表达蛋白质主要参与氧化磷酸化途径。X、Y精子差异表达蛋白说明X与Y精子在运动能力、抵抗氧化应激及能量代谢等方面存在差异。     

p38MAPK信号传导通路及其与细胞凋亡

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是广泛表达的丝氨酸／酪氨酸激酶，在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用，MAPKs有三个主要家族：ERKs。JNKs和p38MAPKs。p38信号通路是MAPK通路的一重要分支，它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。四种已知的p38异构体包括p38a、p38p、p38y和p386。多年来已发现p38MAPK通路可以由应激包括高渗、热休克、放射线和其他应激反应活化。因此，p38MAPK通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且，p38在细胞凋亡和多样性变化中也显示调节效应。     

不同碳源下Pseudomonas putida F1单环芳烃降解相关蛋白质的差异表达

研究了Pseudomonas putida F1利用单环芳香族化合物以及琥珀酸做碳源时单环芳烃降解相关蛋白质的表达,这对于研究这些芳烃的单一和混合降解有重要意义.利用蛋白组学研究方法,通过比较蛋白表达的双向凝胶电泳(2-DGE)图谱,找出不同碳源条件下生长细胞中差异表达的蛋白质.蛋白质经胰酶消化后,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption/ionization-Time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry)分析.结果表明,尽管该细菌在降解甲苯和乙苯时利用同一个代谢途径,但代谢相关蛋白在微生物利用不同碳源时的表达量有所变化.差异表达蛋白可分为4类,代谢蛋白,转运蛋白,适应性相关蛋白以及其他类型蛋白.