大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

利用野生型大肠杆菌MG1655为宿主菌,从下水道污水中分离得到一株噬菌体,编号为Phage 1.其噬菌斑大小为3～4mm,透射电镜观察发现该噬菌体有正多面体头部和弯曲尾部,属于长尾科噬菌体.对该噬菌体的生物学特性包括最佳感染复数、一步生长曲线、温度、氯仿、pH进行检测,结果显示该噬菌体的潜伏期为10min,繁殖周期为20min,对温度、氯仿以及pH耐受性良好.经基因组测序鉴定,该噬菌体为E.coli T1噬菌体.     

珊瑚来源群体淬灭活性产生菌的筛选与抑菌活性研究

珊瑚病原菌的群体感应（Quorum Sensing，QS）是介导珊瑚疾病发生的重要因素，抑制病原菌的群体感应可以有效抵抗病原菌的侵染作用。为解决耐药性难题并维持珊瑚礁生态系统健康，本研究以紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）为指示菌，从三亚市鹿回头半岛三亚湾（109°28''E，18°13''N）采集的珊瑚样品中，分离筛选具有较高群体淬灭酶活性的珊瑚共附生细菌，经16S rDNA测序初步鉴定其大部分为弧菌属。进一步研究群体淬灭活性菌株对两株珊瑚致病菌溶珊瑚弧菌V545（Vibrio coralliilyticus）和溶藻弧菌Z-14（V.alginolyticus）的生长、运动及生物被膜生成的影响。结果显示，5株群体淬灭活性菌株明显抑制溶珊瑚弧菌V545及溶藻弧菌Z-14的生长，8个菌株对溶藻弧菌Z-14的运动有明显抑制作用；9个菌株可显著抑制溶珊瑚弧菌V545生物被膜形成，13个菌株可显著抑制溶藻弧菌Z-14的生物被膜形成，其中11个菌株对溶藻弧菌Z-14生物被膜生长抑制率均超过85%；部分群体淬灭活性菌株对溶珊瑚弧菌V545和溶藻弧菌Z-14的生长、运动及生物被膜形成均有显著抑制作用。本研究筛选获得具有群体淬灭活性的细菌，并揭示其群体淬灭活性对珊瑚致病菌生长、运动、生物膜生成的影响，为解决珊瑚微生物抗病机制提供理论依据与原创材料。     

一株新铜绿假单胞菌噬菌体SRT6的分离以及全基因组序列分析

分离一株新铜绿假单胞菌噬菌体,进行生物学特征分析,全基因组测序和比较基因组学分析.了解该噬菌体与其他假单胞菌噬菌体之间的亲缘关系以及它的潜在应用价值.利用双层平板法分离纯化噬菌体,利用酚氯仿抽提基因组,利用Illumina Hiseq测序平台对基因组测序,利用生物信息学进行基因组和比较基因组学分析.分离到一株新的烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,其基因组全长91 364bp,G+C含量49.3%,存在182个蛋白质编码基因,其中的96个与已知功能的蛋白质具有相似性,无tRNA和tmRNA.比较基因组分析发现,噬菌体SRT6属于一个新物种.分离鉴定出一株烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,并发现它属于一个新种噬菌体,为未来利用噬菌体治疗耐药铜绿假单胞菌感染打下坚实的基础.     

应用噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的可行性研究

探讨了应用哈维氏弧菌噬菌体检测对虾发光病致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的方法和可行性.实验表明,从对虾育苗场分离的哈维氏弧菌噬菌体对对虾发光病致病菌哈维氏弧菌的噬菌作用具有相当高的特异性,它不能裂解同样来源的溶藻弧菌、副溶血性弧菌、光合细菌,却能特异地裂解本实验所用的不同来源的哈维氏弧菌,噬菌斑出现率可达80%~100%,并且噬菌斑的出现率与虾苗发生发光病的发病程度有一定的相关性,可应用于哈维氏弧菌的检测和对虾发光病致病菌的诊断.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼鳃粘液的影响

用3H-TdR同位素标记方法研究了分离自患病大黄鱼的溶藻弧菌和健康大黄鱼的7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附动力学以及拮抗菌对溶藻弧菌粘附的影响,试验结果表明:溶藻弧菌和7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附都属于饱和粘附;溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液的最大粘附量为4.1×105cells/well,7株拮抗菌的最大粘附量和亲和指数都高于溶藻弧菌;各菌株的分离常数都高于自身的最大粘附量,总体上呈现最大粘附量高的菌株其分离常数也大的趋势.7株拮抗菌在置换条件下都能显著降低溶藻弧菌对鳃粘液的粘附量,在竞争条件下有5株能够显著降低溶藻弧菌的粘附量,在排斥条件下仅有3株能够显著降低溶藻弧菌的粘附.结果表明:病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液有较强的粘附作用;7株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌的粘附,其中置换作用效果最好,排斥作用效果最差;拮抗菌和病原菌的粘附动力学特征可在一定程度上反映它们的相互作用效果,但是仅仅根据各菌株自身的粘附动力学特性无法推断其对病原菌粘附的抑制能力.     

我国首株噬藻体(蓝藻病毒)的分离与鉴定

分离得到一株裂解织线藻和席藻的噬藻体.对该噬藻体的研究发现:光照条件是感染所必需的,但不依赖于金属离子(如镁离子);裂解织线藻的周期(27℃条件下)为4h,其中潜伏期为3h,最后的1h为裂解期,病毒释放量约200PFU/细胞,感染过程中,织线藻的放氧速率急剧下降.此外还发现:40℃下处理10min,噬藻体保持100%活性;50℃下处理1min,失活率小于25%;50℃下处理10min,失活率为40%;60℃下处理1min,失活率为85%;60℃下处理10min,失活率大于99%.在电子显微镜下可以观察到此病毒为噬菌体形态,头部直径为52nm,尾部很短,几乎不可见.该噬藻体的遗传物质为双链DNA,基因组约36kb.     

一株海洋蛭弧菌类生物对海水细菌的生物控制和水质的影响

 研究了一株海洋蛭弧菌类生物(Bdellovibrio-and-like organisms,BALOs) DA5与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）在海水中共培养时的相互作用;并研究了DA5对添加营养的自然海水中细菌的生物控制效果及对水体pH、化学需氧量(COD)、氨氮(NH₃-N)和亚硝酸氮(NO₂-N)含量的影响。结果表明DA5在振荡培养条件下对溶藻弧菌具有明显的裂解作用,较高的感染比有助于快速减少寄主菌,但长时间的共培养也不能完全清除溶藻弧菌。DA5对自然海水中异养细菌和弧菌均有一定的清除作用,且对弧菌的消减作用更明显,但对水体pH、COD、NH₃-N和NO₂-N含量均无显著影响,且BALOs含量总体上与细菌或弧菌的含量呈正相关。     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明:通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

溶藻细菌L7的高密度培养及溶藻活性物质提纯鉴定

  针对一株溶藻细菌L7,探索溶藻细菌高密度培养的工艺参数及溶藻活性物质提纯鉴定的关键技术,为生物杀藻剂的研制奠定理论基础。在溶藻细菌L7的高密度培养阶段,通过设置单因素实验及正交实验、应用摇瓶及自动发酵罐筛选出适宜培养溶藻细菌L7的培养基（碳源葡萄糖、氮源氯化铵、C/N质量比3∶1、初始pH值7.5）、细菌接种量3.1×10⁷ cfu/mL、DO［30%（±10%）］及搅拌速率［(160±10)r/min］;在溶藻细菌L7溶藻活性物质的提纯鉴定阶段,通过透析、凝胶柱层析、高效液相色谱、液质联用仪等物质提纯鉴定手段,获得2种溶藻活性物质,相对分子质量分别为588.2、365.0,相较而言,相对分子质量为365.0的物质的溶藻作用更强。     

一株尿路致病性大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

本研究从尿路感染患者尿液样本中分离、鉴定大肠杆菌裂解性噬菌体,对其裂菌活性等生物学特性进行分析,为探索应用噬菌体治疗耐药性尿路致病性大肠杆菌导致的尿路感染奠定基础。利用双层琼脂平板法,从尿液样品中分离、纯化,得到一株能裂解大肠杆菌的噬菌体。通过电镜观察噬菌体形态,测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线、以及热稳定性、紫外敏感性和氯仿敏感性等生物学特性。结果显示,成功分离、纯化得到一株能高效裂解大肠杆菌的噬菌体vB_EcoS_JA2,该噬菌体可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑;电镜观察噬菌体的头部呈六边形,含可收缩性尾部,尾部较长;一步生长曲线显示,该噬菌体的潜伏期为10 min、爆发期为60 min、裂解量高达124 PFU/Cell,其最佳感染复数为0.1;JA2具有较好的热稳定性,且对紫外线具有一定的抵抗力。分离鉴定的噬菌体JA2能裂解致病性大肠杆菌,具有稳定性好,抵抗力强的特点,为应用噬菌体治疗致病性大肠杆菌导致的尿路感染提供了新材料。     

广西北部湾大宗海水养殖鱼类卵形鲳鲹感染溶藻弧菌及其致病性研究

【目的】2016年广西钦州湾近海网箱养殖的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)发生以体表皮肤溃烂、皮下出血、内脏器官病变为典型症状的细菌性疾病,通过对患病卵形鲳鲹中病原菌进行分离、鉴定与保存,为后续开展病原菌快速检测技术和防控技术等研究,以及控制相关病原菌在海水养殖中的暴发和流行奠定基础。【方法】利用LB平板和TCBS平板从患病卵形鲳鲹体表溃烂病灶、肾脏、肝脏组织中分离纯化疑似病原菌,并对其进行常规形态特征和生理生化反应的生物学检验,通过16SrDNA基因测序对疑似病原菌株进行分子生物学鉴定,在细胞和鱼体水平开展病原菌的致病性研究,同时进行人工感染的回接试验。【结果】分离得到4株疑似病原菌(TOQZ01,TOQZ02,TOQZ03,TOQZ04),基于其表型、分子生物学特征和进化关系,判定4株菌株均为弧菌属的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),且细胞毒性试验和回归试验证实,分离得到的溶藻弧菌为此次卵形鲳鲹发病的病原菌。【结论】溶藻弧菌是引起广西沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,未来将基于本研究中分离得到的溶藻弧菌开展病害快速检测技术和防控技术等现代海水生态健康养殖关键技术研究,以实现对广西海水养殖溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

杂色鲍( Haliotis diversicolor Reeve) 消化腺细菌的初步研究

从正常杂色鲍（无病症，腹足吸附力强）的消化腺分离到5个细菌菌株：1－1－3，3－1－1，4－1－1，5－3－3，5－4－3。经VITEK－AMS－60自动鉴定系统鉴定，前4株均为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus），后1株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)。溶藻弧菌4个菌在形态、生理生化鉴定上虽有差别，但基本上是一致的。5－4－3恶臭假单胞菌与其它4株 差别较大。溶藻弧菌4菌株对卡那霉素等12种药物敏感，对青霉素G等7种药物有耐受性，恶臭假单胞菌对卡那霉素等8种药物敏感，对青霉素G等15种药物有耐受性。     

犬细小病毒CPV-SHZ分离株VP2基因的克隆与序列分析

以本实验室分离鉴定犬细小病毒新疆石河子株（CPV-SHZ）的DNA为模板,根据基因库已发表CPV序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,进行聚合酶链式反应,扩增出约1.7kb的片段,按常规方法克隆进pMD18-T载体,经EcoR I和Sal I双酶切筛选到阳性质粒。测序得到VP2全基因组序列,并登陆Genbank（EU170352）。进一步对该片段进行序列分析,结果表明：所扩增基因片段长度为1755bp,与CPV参考株毒株V154（Type2a）、LCPV-V204（Type2b）、LCPV-V139（Type 2c（a））、LCPV-V203（Type 2c（a））,其核苷酸的同源性分别为99.32%、98.75%、98.97%、98.69%,确定CPV-SHZ株基因型为2a型,将其同我国和世界其他国家主要分离株进行基因系统发生进化关系分析,结果表明,其与我国北京分离株BJ018/07亲缘关系较近。     

溶藻弧菌vscO基因在不同环境下的表达差异

为阐明溶藻弧菌vscO的在不同环境下的表达情况,用半定量RT-PCR方法检测vscO mRNA在不同生长时期、不同环境因子（温度、盐度和pH值）培养下的相对表达量.结果表明,溶藻弧菌vscO在对数期,温度为28 ℃,盐度为2%以及培养基起始pH值为7.0时的表达量最高.     

鸡白痢沙门氏菌O12特异性噬菌体的分离及生物学特性研究

采用双层平板培养法从成都某养鸡场的污水样本中分离得到一株鸡白痢沙门氏菌O₁₂(宿主菌)的噬菌体(Ph-1), 并对菌斑形态及理化特性进行了初步研究. 试验结果显示, 纯化后该噬菌体的噬菌斑直径约3mm; 经高于60℃温度处理1h 后噬菌体失活; PH5-7时该噬菌体可保持较高效价和较强的紫外线耐受性; 该噬菌体的最佳感染复数(MOI)为 0.01-0.001; 一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期为40min, 裂解期持续60min.     

鸡白痢沙门氏菌O_(12)特异性噬菌体的分离及生物学特性研究

采用双层平板培养法从成都某养鸡场的污水样本中分离得到一株鸡白痢沙门氏菌O12(宿主菌)的噬菌体(Ph-1),并对菌斑形态及理化特性进行了初步研究.试验结果显示,纯化后该噬菌体的噬菌斑直径约3mm;经高于60℃温度处理1h后噬菌体失活;PH5-7时该噬菌体可保持较高效价和较强的紫外线耐受性;该噬菌体的最佳感染复数(MOI)为0.01-0.001;一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期为40min,裂解期持续60min.     

环境因素对溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影响

为了研究不同环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HN08155生物膜形成的影响,本研究采用改良的微孔板方法,结果显示:在3个不同培养基中,于2216E培养基中生物膜形成的速度最快,与其他实验组存在明显差异;在p H4~9范围内,当p H值为7.0时,溶藻弧菌形成的生物膜量最高;质量浓度为0.5%的Na Cl最适宜溶藻弧菌生物膜的生成,但Na NO3不能促进生物膜的形成;低浓度Ca Cl2可促进生物膜形成,Mg Cl2不参与溶藻弧菌生物膜的生成.由此得出结论:溶藻弧菌生物膜的形成依赖于环境条件,不同环境因子对溶藻弧菌生物膜的形成有不同的影响.     

鸡白痢沙门氏菌O12特异性噬菌体的分离及生物学特性研究

采用双层平板培养法从成都某养鸡场的污水样本中分离得到一株鸡白痢沙门氏菌O12 (宿主菌)的噬菌体(Ph-1), 并对菌斑形态及理化特性进行了初步研究. 试验结果显示, 纯化后该噬菌体的噬菌斑直径约3mm; 经高于60℃温度处理1h 后噬菌体失活; PH5-7时该噬菌体可保持较高效价和较强的紫外线耐受性; 该噬菌体的最佳感染复数(MOI)为 0.01-0.001; 一步生长曲线显示该噬菌体的潜伏期为40min, 裂解期持续60min.     

一株多药耐药Comamonas kerstersii细菌的基因组分析（英文）

从1名尿路感染患者中分离出了1株多药耐药的Comamonas kerstersii(C.kerstersii)菌株121606,对其进行了抗微生物药敏试验(AST)和全基因组测序;然后将其与7个具有代表性的Comamonas菌株和Acidovorax菌种进行基因组比较分析,包括使用OrthoANI分析平均核苷酸同一性(ANI),以及通过snpTree网络服务器进行单核苷酸多态性(SNP)分析。最后,使用RAST服务器进行基因组序列,使用OrthoVenn软件对同源簇进行功能注释,通过CARD数据库对抗生素耐药基因(ARGs)进行预测,并利用CRISPR识别工具预测CRISPR,以及利用PHAST软件预测前噬菌体。结果表明：C.kerstersii 121606是一种多药耐药细菌,其遗传成分与其他7个Comamonas和Acidovorax菌种相似;其基因组中存在的ARGs有助于解释其多药耐药机制。这些发现为研究新型抗生素来控制多药耐药C.kerstersii感染提供了有价值的见解。