中华猕猴桃蛋白酶羧基的化学修饰

有关中华猕猴桃蛋白酶(Actinidin,E C 3、4.22.14)催化功能基团的研究表明:CYSH—25、His—161为酶活性部位必需基团,而Lys和Trp残基为酶活力表现所必需。本文中报道应用水溶性碳二亚胺(EDC)修饰动力学方法,进一步探讨羧基     

文昌鱼酸性磷酸酯酶色氨酸残基的修饰

从厦门文昌鱼(Branchiostonia belcheri Gary)分离纯化获得聚丙烯酰胺胶电泳单一蛋白区带的酸性磷酸酯酶(EC3.1,3.2)应用化学修饰方法,荧光以及紫外-可见光谱的变化,探讨Trp残基与酶活力的关系,被NBS修饰的Trp基团仅有一个Trp残基被氧化时,酶活力丧失90％,该Trp残基为ACPase表现活力所必需,而且优先被氧化、从光谱扫描(230～600nm)结果表明,经NBS修饰以后的酶构象发生变化,文昌鱼ACPase的Trp残基和酶分子上的铁离子等基团均为酶活力的必需基团,推测两者可能以配位结合,共同维持酶活力中心的构象。     

中华猕猴桃蛋白酶催化功能基团的研究

从野生中华猕猴桃分离提纯得SDS电泳单一纯酶制剂,酶蛋白的总巯基数为7,其中游离巯基数为1.3×10~(-5)MpCMB使酶活力丧失100％,酶修饰失活呈一级反应,表明酶分子的唯一游离巯基为该酶催化活性的必需功能基团.酶在2×10~(-4)M PMSF,活力仍不受影响,提示Ser残基与酶的催化功能无关.以Na_2S_4O_6保护游离巯基,用NBS修饰Trp残基,并辅以紫外光谱和萤光光谱分析.结果表明Trp残基为酶催化功能所必需.初步的CDC化学修饰结果亦表明,羧基似与酶催化活性有关.     

文昌鱼碱性磷酸酶的必需基团研究

对文昌鱼碱性磷酸酶的化学修饰研究结果表明:二硫键、赖氨酸残基和色氨酸残基与酶活性有关系。动力学方法测定酶活性基团的解离常数PK值为10.3,这数值与赖氨酸的ε-氨基的解离有关。活性基团的定量分析表明每个酶分子只有一个色氨酸残基是酶活性所必需的。     

锯缘青蟹碱性磷酸酶活性功能团研究

应用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱及荧光发射光谱的变化研究锯缘青蟹碱性磷酸酶的功能基团性质，结果表明：色氨酸的吲哚基团、赖氨酸的ε－氨基、组氨酸咪唑基及精氨酸残基是酶活性必需基团，而巯基与酶活性无关．     

文昌鱼碱性磷酸酶赖氨酸基团的研究

关于文昌鱼碱性磷酸酶(AKP)的基本性质及功能基团等,本实验室作了系统的研究,判定1个色氨酸残基为酶活性中心所必需,赖氨酸残基(Lys)是AKP活性必需基团之一,而每分子AKP上含有36个Lys。在此基础上,采用化学修饰剂对Lys基团进行定量研究,并探讨其它功能基团的性质,为酶的结构与功能关系提供进一步的信息。     

黑眉锦蛇小肠碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质研究

作者对黑眉锦蛇小肠碱性磷酸酶（AKP）进行了分离纯化,对其部分性质进行研究的结果表明,Ser,Thr,Lys和Trp残基是黑眉锦蛇小肠AKP的必需功能基团,部分二硫键对保护酶的催化功能也是必需的。     

菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

从菜青虫表皮分离纯化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase），获得电泳单一纯的酶制剂，通过化学修饰法研究该酶的活性必需基团．分别以碳化二亚胺（EDC）、N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、对-氯汞苯甲酸（pCMB）、二硫苏糖醇（DTT）、澳代乙酸（BrAc）和乙酰丙酮在特定条件下对该酶进行特异的化学修饰，结果表明酸性氨基酸的侧链羧基、半胱氨酸巯基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、二硫键被修饰后，酶活性均显著下降，因此这些氨基酸残基是酶活性的必需基团，而精氨酸残基及赖氨酸ε-氨基被修饰后对酶活力没有影响，不是酶的必需基团．     

地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶色氨酸残基和巯基的化学修饰

用N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）和N-乙基丁二酰亚胺（NEM）分别对A．4041α-淀粉酶的主要组分α－Ⅲ的色氨酸（TrP）残基和巯基进行修饰．结果表明，50％的Trp残基被NBS修饰，可使酶活力完全丧失；Ca2+和底物可减少修饰酶的失活；加Ca2+或底物后修饰酶的荧光强度较对照修饰酶有显著提高．表明Trp是催化必需基团，并与结合底物和Ca2+有关．用过量NEM修饰巯基，酶活力改变不大，表明巯基不是酶的催化必需基因，并对酶的热稳定性基本无影响．     

黄牛肝菌凝集素的化学修饰与荧光光谱研究

对黄牛肝菌凝集素(Boletus fulvus lectin,BFL)进行氨基酸化学修饰,结果表明,Trp残基、Tyr残基及Ser/Thr残基的修饰都会对BFL的凝血活性产生影响,表明这些残基是BFL凝血活性所必需的,可能参与了其凝血活性中心的构成.而Arg残基修饰后,BFL的凝血活性未发生改变,表明Arg不是维持BFL凝血活性的必需基团.内源荧光光谱分析结果表明,BFL所发射的荧光是由Trp残基贡献的,且Trp残基在BFL分子中所处的微环境极性较弱,屏蔽于一定的构象当中.温度、pH值及变性剂对BFL内源荧光光谱的影响与基本理化性质的实验结果一致.氨基酸修饰对荧光光谱的影响表明,Trp残基修饰会引起BFL內源荧光光谱较大变动,而Tyr、Ser/Thr残基修饰对BFL內源荧光光谱影响不大.     

北京鸭红细胞超氧化物歧化酶—分离纯化和性质

采用氯仿—乙醇分级分离,丙酮沉淀以及DE-32纤维素柱层析的方法,从北京鸭红细胞中分离得到纯的铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)。4升鸭血红细胞的SOD制品总活力为375,400u,比活力为13,410u/mg蛋白,回收率为64％。 铜锌超氧化物歧化酶制品呈淡蓝绿色,最大紫外吸收波长为258nm。测得该酶分子量为32,000,亚基分子量为16,000。该酶亚基由150个氨基酸残基组成,不含色氨酸,并测得它的N—末端氨基酸为丙氨酸。     

猪末端转脱氧核苷酸酶的分离纯化

末端转脱氧核苷酸酶催化脱氧垓苷三磷酸连接到单链多聚脱氧核苷酸的3′—OH末端。猪胸腺匀浆抽提液,经磷酸纤维素吸附层析,硫酸铵分级沉淀,DEAE—纤维素负吸附,葡聚糖凝胶G100过滤和两次羟基磷灰石柱层析,分离后得到该酶,纯化倍数达2736倍。葡聚糖凝胶G100过滤分离出三个活力峰,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其分子量分别为60000,53000和32000道尔顿,其中53000组分比活最高,达每毫克蛋白3135活力单位。     

短裙竹荪（Dictyophora duplicata）多糖的研究（Ⅰ）──Dd多糖的分离、纯化及其部分理化性质

竹荪子实体经热水提取，乙醇沉淀，蛋白酶法和Ｓｅｖａｇ法相结合去蛋白，再通过ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱层析纯化，得到竹荪多糖（简称Ｄｄ）纯品。经凝胶过滤法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定表明，Ｄｄ多糖为均一的物质。Ｄｄ经紫外扫描，无核酸和蛋白质的特征吸收峰，ＩＲ－４００扫描表明有典型多糖吸收峰，Ｄｄ的相对分子质量约为１９６０００。     

红壤中微生物总DNA的分离与纯化

采用2种不同的土壤DNA直接提取方法,提取了4种不同类型红壤的微生物总DNA,并对提取的DNA用Sephadex G-200离心层析法进行了纯化。结果表明:2种方法都可以从红壤中提取到分子量大于10kb的DNA的片段,不同提取方法获得的DNA的产量存在较大差异。方法二用冻融进行预处理再结合SDS和溶菌酶的化学裂解方法,是效果较好的DNA抽提方法。其提取DNA产量高,重复性好,适合于土壤少量样品的DNA提取。Sephadex G-200离心层析法能较好地去除土壤中的有机物杂质,DNA溶液由原来的黄褐色变得澄清透明,且不会使提取的DNA断裂或损失,是一种较好的土壤微生物总DNA纯化方法。     

改良的大豆种皮过氧化物酶纯化方法及酶的底物氧化特性研究

由大豆壳中分离出一种过氧化物酶-大豆种皮过氧化物酶(soybeanhullperoxidase,SHP,EC1.11.1.7),经硫酸铵分级沉淀,DEAE-SephdexA-50离子交换层析,Bio-GelP-60凝胶过滤,DEAE-SephadexA-25二次离子交换和SephdexG-100凝胶过滤纯化了该酶.分子量为3.8×104u,薄层等电聚焦电泳测得SHP等电点为3.9.SHP的底物范围较宽,以H2O2为电子受体,可以氧化多种木素单体模型物,包括愈创木酚、2,3-二甲氧基酚、2,6-二甲氧基酚、3,4-二甲氧基酚、3,5-二甲氧基酚、1,2,4-三甲氧基苯、阿魏酸、咖啡酸、异丁子香酚和丁香醛联氮,提示该酶在木素的生物降解中有潜在的应用价值.     

蛹虫草发酵产物新纤溶酶的分离纯化

笔者所在项目组的前期研究发现,蛹虫草深层培养可以产生至少两种纤溶酶.基于此,文中对蛹虫草深层培养产生的纤溶酶的分离纯化展开了研究.采用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶色谱、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色谱、CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱和Superdex 75凝胶色谱对纤溶酶进行分离.最终纯化后的纤溶酶Ⅰ比活力达1467.44U/mg,纯化倍数为36.07,回收率为5.79%.纤溶酶Ⅱ比活力达1681.58U/mg,纯化倍数为41.33,回收率为4.00%.两种纤溶酶经电泳鉴定均达到电泳纯,相对分子质量分别约为28000和32000.     

植物苯丙氨酸解氨酶的研究——Ⅱ 鹰嘴豆、无壳葫芦籽苯丙氨酸解氨酶的亲和层析纯化及其部分性质研究

鹰嘴豆和无壳葫芦籽黄化苗中苯丙氨酸银氨酶(PAL)经亲和层析纯化,聚丙烯酸胺凝胶电泳和SDS—FAGE鉴定均为一条蛋白带,用SDS-PAGE测得鹰嘴豆和无壳葫芦籽PAL亚基分子量分别为55000和74000。Sephadex G—200凝胶过滤法测得鹰嘴豆和无壳葫芦籽PAL分子量分别为205 000和280 000。表明这2科植物PAL均由分子量相同的4个亚基构成。     

双孢蘑菇子实体超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及部分性质

采用硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析、Sephadex G-150分子筛柱层析分离纯化了双孢蘑菇(Agaricus bisporus)子实体超氧化物歧化酶.纯化了31倍,回收率为10.51%,纯酶比活力为5 512.6 u/mg,酶的最适作用温度为25 ℃,最适pH值为8.0,酶在25 ℃以下比较稳定,亚基分子质量为21 kD,全酶分子质量为43 kD, 该酶由2个相同的亚基组成.     

菠萝焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶的分离纯化及性质研究

应用硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素、Sephadex G-200、磷酸纤维素柱层析分离纯化了菠萝叶片焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸转移酶(PFP).凝胶过滤和非变性聚丙烯酰胺梯度电泳测定酶的分子量为132kD和140kD,SDS-聚丙烯酰胺电泳分析得到一条分子量为66kD的蛋白主带,表明该酶可能是由同种亚基组成的二聚体.此外,还对该酶的部分酶学性质进行了初步研究.