免疫PCR方法检测乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体

目的为乳腺癌诊断提供血清学新方法.方法免疫PCR方法检测血清抗p53蛋白抗体,酶免疫组化方法检测组织p53蛋白表达.结果乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体阳性率为39.5%,而非癌患者和正常人血清抗p53蛋白抗体均为阴性,乳腺癌患者血清中抗p53蛋白抗体显著高于非癌患者和正常人(P＜0.01).p53蛋白阳性表达的乳腺癌患者抗p53蛋白抗体阳性率为64.2%,明显高于p53蛋白阴性表达组,血清p53抗体测定与p53蛋白表达密切相关(P＜0.01).结论检测血清抗p53蛋白抗体是检测组织p53蛋白理想的替代工具抗p53蛋白抗体可以作为乳腺癌血清学诊断新标志,用于乳腺癌的普查和早期诊断.     

噬菌体展示蛋白质芯片的无标记检测

为获得丰富的特异识别分子和实现无标记、高灵敏度检测,利用噬菌体展示技术,选择在pⅢ蛋白上展示12肽的噬菌体M13作探针,采用羧基-氨基共价耦联法制备噬菌体展示蛋白质芯片.在此基础上,与表面等离子体共振传感技术结合,使用Biacore3000仪器,检测噬菌体展示蛋白质芯片与特异性抗体的反应,测定反应动力学常数.实验结果表明:当抗体浓度为0.4 μmol·L-1时,响应信号可达365±8个单位;不同浓度的抗体与芯片反应的数据较好地与S型曲线吻合.该方法可望用于噬菌体展示蛋白质芯片的检测.     

乳腺癌自身抗体标志物的筛选和鉴定

目的:应用自身抗体技术从乳腺癌cDNA T7噬菌体展示文库筛选乳腺肿瘤相关抗原。方法:运用生物淘洗富集技术、噬菌斑转印分析和免疫化学检测方法,用正常人和乳腺癌病人血清从一个乳腺癌cDNA T7噬菌体文库中筛选肿瘤相关噬菌体克隆。通过PCR和测序的方法分析开放阅读框架内的序列,BLAST比对识别出这些噬菌体表达蛋白。然后用酶联免疫吸附(ELISA)的方法对87个乳腺癌病人和87个正常人血清样品,检测每一个开放阅读框架内的噬菌体表达蛋白的自身抗体。用逻辑回归模型和留一交叉验证评估单个标志物和多标志物联合诊断的准确率。结果:筛选得到3个开放阅读框架之内的噬菌体克隆ASB-9,SERAC-1和RELT。用87份乳腺癌病人血清和87份正常人血清对这3个噬菌体表达蛋白进行验证,逻辑回归模型联合检测的敏感性达到80%,特异性达到100%;留一交叉验证3者联合的预测值敏感性和特异性分别达到76.5%和82.4%。ROC曲线分析和留一法都表明多个标志物联合检测的价值要高于单标志物,预示着多标志物联合在诊断中的重要性。结论:对乳腺癌来说,血清自身抗体是其早期检测和诊断的一种有效方法,而且多抗体联合应用可实现更高的诊断准确率。     

噬菌体筛选技术筛选与联萘酚(BINOL)相结合的抗体

利用噬菌体展示技术筛选只结合1种对应体的BINOL抗体,建立人类单链抗体(scFv)噬菌体文库--Griffin.1文库,以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.从经过4轮富集的次级抗体库中挑选到噬菌体克隆,用该克隆制备的单链抗体阳性克隆,经ELISA证实具有良好的抗原特异性.从人类scFv噬菌体文库中获得抗BINOL的特异性抗体.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先， 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次， 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后， 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建

构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库. 首先, 从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因, 将其截短、 修饰、 简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列. 其次, 将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、 酶切, 链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上, 构成重组噬菌体DNA. 最后, 重组噬菌体DNA经体外包装和扩增, 得到T7噬菌体展示文库, 并进行T7噬菌体展示文库滴度、 重组率和免疫活性测定. 实验结果表明, 从Gene Bank中查找、 筛选、 剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库, 原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL, 重组率大于90%. 用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获, 经聚合酶链式反应(PCR)鉴定, 得到理想目的条带, 证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性, 可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.     

抗癌胚抗原纳米抗体展示文库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术进行纳米抗体库的构建和筛选,获得抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,为相关癌症诊断及靶向治疗的应用奠定基础。使用重组CEACAM5抗原免疫羊驼,分离免疫后羊驼的外周血淋巴细胞,提取总RNA后通过RT-PCR技术扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段,构建纳米抗体文库。采用噬菌体展示技术和固相淘选方法,筛选得到强阳性克隆,经大肠杆菌表达和镍离子亲和层析获得纳米抗体,最终利用Biacore分析其亲和力和特异性。通过3轮的淘选,获得一株纳米抗体亲和力达到2.6×10-10mol·L-1,对同源性蛋白CEACAM-1、-3、-6、-8及肿瘤蛋白AFP均无交叉反应性。利用噬菌体展示技术成功获得了抗癌胚抗原(CEACAM5)的高亲和力、强特异性纳米抗体,可用于后续相关癌症诊断和靶向治疗。     

抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定

利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础.     

传统抗原、重组抗原检测啮齿类动物病毒的ELISA法敏感性和特异性

酶联免疫吸附试验 (ELISA)是一种常用的检测啮齿动物血清病毒抗体的方法。用于检测血清抗体的抗原可是用常规方法制备的全病毒或是在原核或真核系统中表达的重组抗原蛋白。利用杆状病毒表达系统已获得细小病毒、沙粒样病毒和冠状病毒的带有His标记的重组病毒抗原。重组抗原在昆虫细胞中表达裂解后 ,可用色谱法提纯。提纯的抗原用来包被 96孔ELISA板。用细小病毒非结构蛋白 (NS 1) ELISA法检测啮齿动物血清 ,在检测的 345 7份样本中有 88份 (2 5 % )NS 1抗体阳性 ,9份 (0 3% )为非特异性反应。虽然NS 1ELISA检测NS 1抗体具有…     

人源噬菌体抗体库的构建及抗D-二聚体抗体的获得

目前国际和国内筛选蛋白所用的技术主要是噬菌体展示技术和酵母双杂交技术。噬菌体展示技术在抗体的筛选方面已显示出良好的应用前景。本实验应用噬菌体展示技术展示出血栓病人的抗体，形成对血栓病人的抗体库。并从中淘选出能与血栓降解产物之一的D-二聚体有特异结合作用的抗体Fabp13。抗D-二聚体的Fab在XL1-Blue中得到可溶表达。再利用抗D-二聚体抗体进行竞争ELISA检验，证实p13具有抗D-二聚体的活性。从而我们筛选得到了抗D-二聚体抗体Fab p13。     

噬菌体展示外源多肽的免疫原性研究

利用噬菌体展示技术将丝状噬菌体fd基因8克隆入pKK223-3质粒中，将白色念珠菌特异表位基因插入到修饰后的质粒载体中，并制备了杂合噬菌体，利用纯化的该表位抗原PA免疫小鼠，结果表明该噬菌体-表位抗原PA在有无佐剂存在的情况下均产生抗体，用ELISA方法采用双波长（450/630nm)检测抗体，其在有无佐剂存在的情况下光密度值无明显差别，免疫后小鼠脾淋巴细胞在有无佐剂的情况下均产生明显增殖，未见明显的毒副作用，具有良好的安全性，该方法产生的抗体与传统的合成多肽相比具有方法简便、低价高效等特点，它将成为生产高效低价疫苗的有效途径，该噬菌体-表位抗原PA为真菌疫苗的研制打下基础。     

兔抗Ｍ１３噬菌体酶标抗体的制备

M13噬菌体已被广泛地应用于噬菌体展示技术.M13的酶标抗体,是在噬菌体展示技术筛选结果ELISA检测中不可缺少的试剂.我们制备了兔抗M13抗血清,其效价高于1:6000;经两步饱和硫酸铵沉淀,初步纯化了兔抗M13抗体;用过碘酸钠法对抗体进行了辣根过氧化酶的标记,酶标记抗体活性为1:6400.     

噬菌体显示抗乳腺癌单链抗体的基因克隆和筛选

克隆和连接乳腺癌杂交瘤单克隆抗体的轻、重链可变区基因，构建该单链抗体的噬菌体显示系统，经严格的相关肿瘤细胞株的固相细胞正负筛选和多步液相结合-洗脱细胞筛选，得到特异性高、亲和力强的单链抗体基因，用于进一步构建重组免疫毒素，为临床乳腺癌和生物靶向治疗奠定基础.     

乳腺癌血清中MMP-7自身抗体的检测

目的运用ELISA技术测定乳腺癌血清中MMP-7自身抗体,从而推测血清中MMP-7自身抗体对乳腺癌的诊断价值。方法建立最佳优化条件,用间接ELISA检测39例正常人血清、43例乳腺癌患者血清中MMP-7自身抗体的存在情况,进而对检测方法的诊断价值进行评估。结果乳腺癌患者血清MMP-7自身抗体水平明显高于正常人,P〈0.01;ROC曲线分析表明,当选OD450值=1.344为cutoff值时,MMP-7自身抗体用于诊断乳腺癌的敏感性为76.7%,特异性为82.1%。     

鸡传染性支气管炎病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

[目的]建立一种快速、灵敏的胶体金免疫层析法(Colloidal-gold immunochromatography assay),用以检测禽类早期感染鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)和监测IBV疫苗接种免疫水平.[方法]将重组IBV核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白包被在在试纸条检测线,羊抗兔IgG包被在试纸条控制线,用胶体金-兔抗鸡IgG偶联物作为示踪剂,检测血清中IBV抗体.[结果]制备所得的胶体金免疫层析试纸条与IBV抗体阳性血清反应呈阳性,与鸡新城疫病毒抗体阳性血清、鸡传染性法氏囊病毒抗体阳性血清、鸡毒霉形体抗体阳性血清和SPF标准鸡血清未发生交叉反应;当IBV抗体阳性血清以1:35比例稀释后,依然可以用该试纸条检出;该试纸条在60 d的保存期内重复性良好;以从不同养殖场采集到的鸡血清样本作为测试对象,比较该试纸条和进口 ELISA试剂盒的检测结果,两者符合率为97.44％.[结论]成功制备了检测耗时短、检测限低、特异性强、稳定性好的IBV抗体检测胶体金免疫层析试纸条,为鸡传染性支气管炎的早期诊断以及免疫监测提供了简便高效的技术方法.     

SARS-CoV刺突蛋白受体结合区的表达及高潜在中和性人源抗体的制备

为表达SARS-CoV刺突蛋白S(Spike)受体结合区(RBD)并从中筛选高潜在中和性人源抗体,我们用原核表达并纯化的SARS-CoVSRBD进行抗体库的筛选。从多个曾患SARS的健康人血中获得淋巴细胞,PCR扩增全部抗体基因,插入Pcomb3x载体中,构建抗SARS病毒人源噬菌体抗体库。利用噬菌体表面呈现技术,从中筛选结合SARS-CoVSRBD的人源抗体并用ELISA及Westernblot鉴定阳性克隆,竞争ELISA检测人源抗体阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合情况。结果为构建了库容量6.2×107的免疫Fab噬菌体抗体库,重组率为75%,从中筛选获得9株特异抗SARS-CoVSRBD的人源Fab抗体,ELISA及Westernblot检测均为阳性。其中有一株能阻断SARS-CoVSRBD与其受体ACE2的结合。本实验结果表明:人源抗SARS-CoVSRBD基因工程抗体的获得,一方面将对SARS疾病的特异性预防,治疗和诊断提供新的途径,同时也提示SARS-CoV亚单位疫苗可以用于SARS疾病的预防。     

GFAP单克隆抗体制备及ELISA检测方法研究

制备抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体,并尝试建立双抗夹心ELISA检测方法,为出血性脑卒中早期诊断提供基础材料.用重组人GFAP作为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗GFAP单克隆抗体;用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot检测抗体的亚类、表位和特异性;采用ELISA技术制备GFAP检测试剂盒.获得了7株抗GFAP单克隆抗体,抗体亚类为Ig G2或Ig G1,抗体特异性好.抗体配对成功,ELISA检测重组人GFAP灵敏且稳定.     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白基因的表达及其在SARS诊断中的应用

目的为SARS感染后建立一种特异性免疫学诊断方法,为基因疫苗的研制提供备选实验材料.方法利用基因重组的方法,在大肠杆菌中表达了SARS冠状病毒(SARS-CoV)N蛋白全长基因,经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化N蛋白,SDS-PAGE电泳和ELISA方法进行结果检测.结果N蛋白抗原与30名SARS感染患者血清结合全部为阳性,对照组30名正常人血清为阴性,30名发热但非SARS患者血清为阴性.结论利用基因重组的方法对SARS-CoV N蛋白进行了表达和纯化,证明该重组N蛋白抗原具有良好的反应特异性,是良好的应用于病毒感染早期诊断的抗原.完全可用于组构检测核心抗体的诊断试剂.并建立了免疫学的检测方法,为抗体检测提供了安全、方便的手段,并为基因工程疫苗研究奠定了基础.     

从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。