腺相关病毒介导带基因座控制区核心序列的β—珠蛋白基因在红？…

为提高人β－珠蛋白基因在基因转移中的稳定性与在红系细胞中的表达水平，构建了带单个和多个基因座控制区核心序列的人β－珠蛋白基因相关病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体ＡＶ５３ＨＳ２△β２Ｎｅｏ和ＡＶ５３ＨＳ４３２△β２Ｎｅｏ。利用ＡＡＶ载体介导的基因转移将两种重组体导入红系细胞（ＭＥＬ），分析了它们在ＭＥＬ细胞中的整合与表达。结果表明，ＡＡＶ载体介导带多个基因座控制区核心序     

人β地中海贫血β41/42突变基因的克隆和真核表达体系的构建

目的: 克隆人地中海贫血基因β41/42及调控系列LCR,构建该致病基因的体外真核表达体系,为该病基因治疗的研究提供理想模型.方法:抽提β41/42纯合子患者的DNA,PCR扩增出人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β41/42基因,将其串连克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3.1-中,脂质体转染至小鼠红白血病细胞(MEL),DMSO诱导MEL细胞表达,逆转录PCR检测人β41/42基因在MEL中的表达.结果: 成功构建了人β41/42突变基因的真核表达系统.结论:β41/42基因在MEL细胞中的表达情况与设计的表达完全一致,为该病的基因治疗研究提供了一个理想模型.     

红系特异表达载体在转基因小鼠中表达的研究

为在个体水平上研究珠蛋白基因位点控制区的HS2,HS3及HS2-HS3元件对β-珠蛋白基因的时空表达调控作用,选择本实验室构建的CMV/GFP,HS2ALL,HS3ALL,HS23ALL等4种重组载体,经限制性酶切及两步纯化,得到了5种重组DNA片段:CMV/GFP,HS2/GFP,CMV/HS2/GFP,HS23/GFP,HS3/GFP,并用显微注射技术获得转基因小鼠.用流式细胞仪分析转基因各组织中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,结果表明HS2元件及1.7kb的β-珠蛋白启动子足以调控β-珠蛋白基因的组织特异性表达.此外,在不同的转基因小鼠中,GFP的表达虽有明显的个体差异,但综合分析比较可以看出,HS2与HS3元件在调控β-珠蛋白基因表达方面,其增强子作用基本相当,且两者显示出显著的协同作用.     

人核呼吸因子2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建人核呼吸因子2(NRF2-α和NRF2-β)的真核表达载体,并检测其在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞株的表达水平。方法:根据NCBI数据库中NRF2-α和NRF2-β的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增目的基因并构建带FLAG标签的真核表达载体,瞬时转染BEL-7402细胞后,分别使用半定量RT-PCR技术和Western blot技术检测其mRNA和蛋白质表达水平。结果:通过酶切鉴定和DNA序列分析,证实已成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,并能在瞬时转染的人肝癌BEL-7402细胞中实现基因的过表达。结论:成功构建了人NRF2-α和NRF2-β的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件,牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序,人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体,表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达,最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠,hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．     

光控超小型CRISPR/Cas经AAV载体递送实现对人基因组的高效编辑

CRISRP/Cas系统是目前广为使用的基因编辑工具，而腺相关病毒(AAV)也是目前最安全有效的基因治疗递送载体。为了实现AAV载体介导的CRISRP/Cas基因编辑，各种可装载于AAV载体的基因编辑工具也先后被报道。尽管如此，AAV载体介导的时空特异性基因编辑仍较难实现。为此我们结合光遗传学，将蓝光诱导表达系统、超小型CRISPR/Un1Cas12f1基因编辑系统以及AAV载体递送系统进行有机整合，开发出光控诱导表达的超小型基因编辑系统(AAV-PA-Cas12f1),并将其通过AAV递送至人源细胞HEK293T中。在无光条件下其表达背景极低，而经过蓝光诱导实现了对人基因组的高效基因编辑：以Intergene2为例，利用PCR产物-TA克隆结合单克隆测序分析得到该系统的实际编辑效率高达56%,编辑类型为碱基缺失或兼具碱基缺失与插入。此工具的开发为实现体内精准基因编辑奠定了基础，为解析更多生物学机制及探索疾病治疗策略提供了技术平台。     

促血管生成素载体构建及在癌细胞中的表达

[目的]构建人促血管生成素-2(Ang-2)基因的重组peDNA3真核表达载体,为进一步研究Ang-2在肿瘤血管生长上的作用奠定基础．[方法]从人胎盘组织中提取Ang-2总RNA,经过RT-PCR扩增、TA克隆、酶切鉴定、DNA序列分析后,将纯化的Ang-2基因克隆到pcDNA3真核表达载体上,转染Hela细胞,应用RT-PCR方法鉴定细胞表达的mRNA．[结果]RT-PCR得到的产物经DNA测序,与Genebank中人Ang-2eDNA序列一致;构建人Ang-2真核表达载体,转染人Hela细胞,细胞表达Ang-2目的基因mRNA。[结论]成功构建人Ang-2基因真核表达载体pcDNA3-Ang-2．     

腺相关病毒介导锌指核酸酶体外切除HIV-1基因组研究

人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus type 1, HIV-1)能够整合到宿主细胞基因组并通过基因沉默的方式逃避高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antietroviral Therapy, HAART),而高效特异性的基因编辑工具的出现，有望成功切除HIV-1前病毒基因组。重组腺相关病毒(AAV)是基因治疗的重要载体系统，为了获得能够高效感染T细胞的基因编辑工具递送系统，本研究通过比较过表达增强绿色荧光蛋白的血清型2、血清型6、血清型DJ的重组腺相关病毒，筛选出T细胞系的偏好血清型为6型。通过比较CMV启动子、SFFV启动子，筛选出T细胞系的偏好启动子为SFFV启动子。最后，我们通过制备过表达靶向HIV-1长末端重复序列(Long Terminal Region, LTR)的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)的AAV6递送载体系统，感染模拟HIV-1阳性表达的细胞系Ya, T7E1检测证实HIV-1前病毒基因组被特异性切除，流式细胞仪检测证实切除效率约为17.1%,测序分析进一步证实靶向HIV-...     

绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin,BLG)基因启动区序列,从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein,EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells,SFFCs),脂质体介导载体DNA转染SFFCs,激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞,结果表明,增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达,转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的研究中得到有效应用     

人生长激素基因在昆虫细胞中表达的初步研究

将人生长激素hGH的cDNA片段克隆在转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,构成重组转移载体pVL1393hGH,将该质粒DNA与昆虫杆状病毒（AcNPV）DNA共转染秋粘虫（Spodopterafrugiperda）细胞Sf9,通过体内同源重组,hGH基因取代多角体蛋白基因,从而整合到病毒基因组上,经感染昆虫细胞后表达外源hGH基因,通过反复病毒空斑纯化,获不含多角体的重组病毒,利用免疫化学发光法测定hGH表达量达40μg／mL．     

丙型肝炎病毒NS3基因真核质粒的构建及其在人肝细胞中的诱导表达

目的：进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析其在体外培养的人肝细胞中的表达。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1-3011表达载体中PCR扩增出HCVNS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3．1（-）重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法及Western Blotting检测HCVNS3蛋白的表达。结果：所得到的NS3片段正确,序列正确,所构建的真核质粒成功转染QSG7701细胞并表达蛋白,表达的NS3蛋白相对分子质量为70000。结论：成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3．1（-）／NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能有效表达特异性HCVNS3蛋白。     

As2O3对脐血红系祖细胞HOXB6基因表达的调控作用

目的：探讨脐血造血干祖细胞向红系祖细胞增殖过程中HOXB6mRNA表达及As2O3对HOXB6mRNA表达的影响．方法：①采用外培养技术,以As2O3干扰造血干祖细胞,观察HSPC经促红素诱导后,CFU-E集落生成情况．②采用实时荧光定量HR技术检测造血祖细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达．结果：①造血于祖细胞红系祖细胞增殖过程中,各组细胞HOXB6基因均表达,②与正常对照组比较,As2O3可下调HOXB6基因的表达．结论：①HOXB6可能是造血干祖细胞向红系祖细胞增殖分化中的调控基因之一．②As2O3能下调HOXB6基因的表达．     

转座子K1.4可提高荧光素酶基因在转基因家蚕中的整合频率

合适的整合表达载体对于获得转基因家蚕具有重要意义,为此本文构建了包含家蚕转座子Ｋ１．４、丝素基因上游启动子序列和荧光素酶基因ｃＤＮＡ的质粒ＳＫＦＬ以及不含Ｋ１．４的质粒ｐＦＬ,并将其通过扎卵法转移到家蚕受精卵中．通过对当代转基因家蚕５龄幼虫丝腺和蚕体ＤＮＡ进行斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现,荧光素酶基因在家蚕不同组织中的整合是随机的,但携带Ｋ１．４的质粒ＳＫＦＬ的整合频率明显高于质粒ｐＦＬ．这说明转座子Ｋ１．４可以有效提高外源基因在转基因家蚕中的整合频率,从而有可能成为构建转基因家蚕的一种有用的整合载体．     

人Kai-1基因真核表达载体的构建及其体外表达

克隆人Kai-1基因,构建其真核表达载体,并在体外细胞系中进行表达验证。提取人正常肝细胞系HL7702的总RNA,通过RT-PCR其反转录为c DNA;以该c DNA为模板,通过PCR扩增出Kai-1基因的编码区,将该目的片段纯化后亚克隆入真核表达载体pc DNA3.1myc-his(-)中,利用菌落PCR及DNA测序分别对Kai-1基因编码区的大小及序列进行鉴定。将所构建的重组质粒通过脂质体瞬时转染Hela细胞,48 h后裂解细胞,利用Western blot检测有无目的蛋白的表达。测序证实所克隆的Kai-1编码区c DNA正确地插入pc DNA3.1myc-his(-)中,经Western blot检测证实其在Hela细胞中得到表达。成功克隆了人Kai-1 c DNA,构建了其真核表达载体,并在Hela细胞中得到有效表达,为进一步研究Kai-1的功能奠定了基础。     

抗人前列腺素D合成酶嵌合抗体基因的构建

采用RT-PCR技术,从1株稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞中扩增抗体的可变区基因,得2个Vk和1个VH．序列经Igblast比对分析,其中1个VK为鼠骨髓瘤细胞系内固有的无功能基因;另-Vk和VH具备鼠抗体可变区特征,为抗体功能基因．经双酶切,将抗体可变区功能基因分别与表达载体pAG4622、pAH4604中的人IgG相应恒定区相连,构建成抗人L-PGDS的人-鼠嵌合抗体基因。     

利用CRISPR/Cas9方法敲除CBFβ基因及CBFβ真核表达载体的构建

构建CBFβ敲除Hep G2细胞系及CBFβ真核表达载体。CRISPR/Cas9基因敲除,将表达CBFβsgRNA,Cas9的表达载体共转Hep G2细胞,嘌呤霉素筛选基因敲除细胞,构建细胞系。infusion cloning方法构建CBFβ表达载体,Hep G2细胞提取RNA,反转成c DNA,设计CBFβ引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,PCR鉴定,酶切鉴定,测序进一步鉴定。获得了稳定敲除CBFβ的Hep G2细胞系及在Hep G2细胞中稳定表达的CBFβ真核表达载体。为研究CBFβ基因在对乙型肝炎病毒复制的调控及调控机制奠定了基础。     

本氏烟β-1,3-半乳糖苷转移酶基因鉴定、进化及表达分析

β-1,3-半乳糖苷转移酶(beta-1,3-galactosyltransferase,β-1,3-GalT)是植物中特有的酶,作为蛋白质糖基化修饰通路中的重要酶,它可以催化β-1,3键将半乳糖苷转移至糖核心.本研究将本氏烟(Nicotiana benthamiana)作为材料,对其基因组中β-1,3-GalT同源基因进行了系统的鉴定,共得到12个基因.这些基因编码的蛋白序列均包含保守结构域PF00337和PF01762.将本氏烟12个β-1,3-GalT基因与栽培烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的β-1,3-GalT基因进行聚类分析,表明它们分化为2个主要枝(I和II),每个主要枝又进一步分化为2个亚枝.多数基因在根中表达量均较高,然而仅有6个基因在叶片中高表达.采用qRT-PCR,测定在叶片中高表达的6个β-1,3-GalT基因在农杆菌侵染情形下的表达水平,结果表明处于II枝上的基因表达均受到农杆菌侵染的显著诱导,而处于I枝上的基因无论对农杆菌侵染还是对照重悬液的注射,均表现一定程度的表达量的升高,暗示创伤胁迫可能使相应的基因表达升高,从而促进β-1,3-GalT酶进行糖基化修饰反应.     

β-乳球蛋白启动子控制生长激素基因在293细胞中的表达

牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)启动子控制人生长激素(h GH)基因的表达载体p BLGH62可以在转基因小鼠的乳腺上皮细胞中高效表达.为了探索利用此表达载体在培养的细胞中生产人生长激素的可能性,将p BLGH62转染非乳腺细胞-人胚肾293细胞用胰岛素、地塞米松和催乳素进行诱导.结果显示,在细胞培养液中检测到人生长激素,说明p BLGH62能在293细胞中表达并能分泌到细胞外.但是,激素诱导对表达量的影响不明显.此外,人生长激素基因存在着可变剪接现象.