重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

rhBACE的克隆、表达纯化与活性测定

将重组人酸性蛋白水解酶原(rh-proBACE)基因克隆到原核表达载体pET28a质粒中，构建了pET28a-rh-proBACE重组表达载体，并在大肠杆菌菌株Rosetta中进行表达,包涵体中的表达产物溶于6mol／L盐酸胍，经Ni-Sepharose亲和层析纯化后，得到高纯度的rh-proBACE蛋白,将此蛋白在复性液中重新折叠后，于酸性条件(pH4．5)下激活，切去酶原序列，产生有活性的rhBACE蛋白，并利用人工合成多肽底物(BAS-131)测定其活性。     

人纤溶酶原Kringle5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle5结构域的基因,并将其克隆至表达质粒pET25b( )中。重组载体pET25b（ ）/kringle5转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,在12kD处可见明显的表达条带,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在。包涵体经过体外变复性,SP-SepharoseFF离子交换柱一步纯化,15%SDS-PAGE鉴定考染一条带,纯度达95%以上。所得到的目标蛋白明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生。     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

重组人尿激酶原氨基末端片段的制备及活性测定

尿激酶原的N-末端135个氨基酸片段包含了表皮生长因子结构域和环柄结构域，参与了尿激酶原和其受体的结合以及尿激酶原诱导的化学趋化活性．利用RT-PCR，从人脐带静脉内皮细胞中克隆ATF基因．将ATF基因插入pET-29a( )中构建表达质粒pET-29a( )／ATF，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达及纯化后，从每升培养液中获得15mg rhATF，其纯度超过95％．活性测定结果表明rhATF能够阻断尿激酶原与尿激酶受体的结合，并能抑制尿激酶对纤溶酶原以及纤溶酶对尿激酶原的激活．     

盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的原核表达及酶活测定

利用原核表达载体pET-32a构建盐藻磷酸果糖激酶DsPFK基因的表达载体pET-32a-DsPFK.转化大肠杆菌BL21(DE3),通过不同温度及不同浓度IPTG诱导后获得以包涵体形式表达的DsPFK重组蛋白,经亲和层析获得大小44.4kDa的纯化蛋白,通过柱上复性的方法测定重组DsPFK蛋白的酶活为950U.     

Arthrobacter globiformis酯酶基因的克隆、表达和酶活性测定

采用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增了A rthrobacter g lobiform is中酯酶编码基因,与载体质粒连接后在大肠杆菌BL 21(DE 3)中进行表达。以包涵体形式表达的蛋白在8 m o l/L尿素作用下溶解,经过透析复性后获得了具有活性的粗蛋白。产物活性实验表明,酯酶表现出较高的催化活性,为菊酯作为杀虫剂的应用奠定了基础。     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

土元溶栓蛋白的原核表达和活性检测

本文利用兼并引物成功克隆到土元类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因,通过构建该基因的原核重组表达载体及IPTG体外诱导,包涵体蛋白复性,Ni 2+柱亲和层析纯化,最终获得了重组表达目的蛋白.经体外检测,该蛋白具有较好的溶栓活性,这为揭示土元溶栓作用的分子基础及其进一步的开发利用奠定了基础.     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上,分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响;提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略;指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

十二烷基苯硝化选择性的测定

利用对位异构体的对称性由核磁共振氢谱测定了工业十二烷基苯在硝硫混酸中的硝化选择性，发现一硝化产物中对位异构体的比例为７５％￣８０％。以月桂酸和苯为原料，经氯化、酰化和还原合成了正十二烷基苯。在同样条件下研究了正十二烷基苯的硝化，由核磁共振氢谱和气相色谱分析，发现一硝化产物中对位异构体的比例仅为６０％。根据空间位阻效应，对结果进行了讨论，并与甲苯，乙苯，异丙苯等短链烷基苯的硝化结果进行了比较。     

YBCO掺杂效应研究

介绍了YBCO掺杂的基础知识,总结了YBCO各个位置采用典型元素掺杂而导致的超导电性和结构的变化,阐述了掺杂对YBCO的重要影响,并简介了当前YBCO掺杂效应研究中的几个热点问题.     

新疆哈密瓜细菌性斑点病病原的鉴定

2000年6-8月从新疆北部主要哈密瓜产区采集分离纯化11个哈密瓜细菌性斑点病菌株,经致病性测定和细菌形态学、培养性状、生理生化特性及G Cmol%含量测定,确定采自叶片病斑上的9个供试菌为丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseuodomonas syringae pv.lachrymans),而侵染果实的病原菌可能还包括果斑菌（Acidororax.arenae subsp citrulli)。     

高频机组基础振动检测分析

为了找出诱发高频机组基础不良振动的原因，从基础计算模型方面对基础激励与响应进行了分析，以两个高频机组基础为动测实例，经模态分析得出钢筋混凝土构架式基础竖向1阶振动与电机产生共振；应用功率谱法对动力机组及基础平台进行动测，得出平台异常响应频率66Hz为水泵工作频率，调整机器的工作频率可避开不良振源影响，达到明显的减振效果。由此而知，动力机器基础出现不良振动时，不可盲目改变结构的动力特性，应在机器不同工况比如：停机、起机及正常转速下，对机器及基础进行动测并对振动信号进行比较分析，以制定出行之有效的减振方法。     

当代大学生幸福感缺失现象探析

幸福是人类追求的终极目标,也是一个永恒的伦理话题,人类对幸福的自觉追求是推动社会历史进步的动力之一.中国当前社会正处在空前的转型时期,当代大学生幸福感的缺失在相当程度上存在,并呈现出上升趋势.究竟是什么原因导致此现象的出现?作者从对幸福和幸福感的考证入手,具体分析了当代大学生幸福感缺失的原因,并在此基础之上提出了相应的解决之策.     

行政机关违法设定许可的法律责任探析

对于行政许可违法的法律责任问题，人们往往是从行政许可实施违法的角度进行研究，而对于设定违法及其责任追究的探讨却相对薄弱。然而。行政许可设定一旦违法，其对相对人和社会公共利益的损害将会更大，因此，对许可设定的违法及其责任问题进行研究，以避免违法行政行为的发生，促进政府依法行政，不仅必要而且是非常有意义的。     

非线性单主元企业组织规模发展的突变分析

该文简述了突变现象的研究,探讨了突变的内涵;讨论了影响企业组织规模的因素;从定性的角度对企业组织规模发展的突变作了研究,从定量方面给出了非线性企业组织规模的一般函数,探讨了它的近似问题;结合例子,应用突变理论,对企业组织规模发展的折叠型、尖点型突变进行了分析,对寻找突变点的方法进行了小结。