植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.     

稻瘟菌MgCYP51B基因稀有密码子和mRNA二级结构分析与表达优化

在大肠杆菌中异源表达稻瘟菌CYP51(P450-14DM, MgCYP51B)基因,通过对MgCYP51B进行跨膜区预测和同源模建分析,并截短稻瘟菌CYP51B基因,构建了9种不同的重组表达质粒以实现蛋白表达.结果表明：只有pET28-MgB-83在3种宿主菌中实现了表达,且在BL21(DE3)pLysS中表达量最大.通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,发现稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构稳定性对MgCYP51B蛋白的表达都有影响,适用于稀有密码子表达的Rossetta(DE3)并不适用于MgCYP51B基因的最优表达.同时只有翻译起始区二级结构自由能最低的pET28-MgB-83才能实现表达.本研究实现了稻瘟菌MgCYP51B基因在大肠杆菌中的异源表达,证实密码子的偏爱性和翻译起始区二级结构稳定性影响MgCYP51B蛋白表达.     

λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

λ噬菌体切除酶Xis(excisionase)是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质.通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Xis在体外合成,然后克隆到带有类泛素蛋白SUMO标签的定向原核表达载体SUMO-p ETG上,测序正确后,然后转化至E.coli BL21(DE3)细胞可溶性表达.经SDS-PAGE及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白.该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Xis不仅解除了Xis对E.coli宿主细胞的毒害作用,而且实现在E.coli中的高水平可溶性表达.因此,Xis的大量制备,将会促进Gateway克隆技术的广泛应用.     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

诺卡氏菌腈水合酶突变基因在重组大肠杆菌中的高活性表达

为了提高腈水合酶基因的重组表达水平,提出了3种基因策略:在重组大肠杆菌中共表达激活子序列、在重组毕赤酵母中表达以及对α亚基的起始密码子进行定点突变。结果表明:对α亚基的起始密码子进行定点突变的基因策略为最佳方案,突变后的腈水合酶基因在重组E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAM)中表达时,腈水合酶的比酶活(以干菌质量计)提高到51 U/mg。进一步以pET28a为载体,插入突变后的腈水合酶基因,构建重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETNHM。对优选菌株进行培养条件和诱导条件的优化,腈水合酶的最高比酶活达到450 U/mg。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E. coli BL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/L IPTG诱导E. coli BL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白mal E基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.     

重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究

为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。     

改进RBB染色法初步筛选几丁质酶基因chiA的表达

对RBB(Remazol Brilliant Blue)底物染色方法进行产几丁质酶细菌的酶活性筛选,应用几丁质胶体平板诱导表达的筛选取得好的效果.粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA在E.coli中的异源表达过程:首先从质粒pMD-chiA(DH5a)中切出含粘质沙雷氏菌几丁质酶基因chiA的片段,将其插入到表达载体pET-22b( )内,构建成几丁质酶表达质粒pET-chiA.然后,转化进入DH5a感受态细胞内,鉴定正确后将pET-chiA质粒转入BL21(DE3)pLySS中进行表达,并进行初步筛选.     

Characterization of codon usage bias in the dUTPase gene of duck enteritis virus

A comparative analysis of the codon usage bias in the newly discovered dUTPase gene （Assigned Accession No.： DQ486149） of the duck enteritis virus （DEV） and the dUTPase gene of 32 reference herpesviruses was performed. The results indicated that the DEV dUTPase gene encodes a protein of 477 amino acids, which includes five conserved motifs with a 3-1-2-4-5 arrangement. The codon adaptation index （CAI）, effective number of codons （ENC）, and GC3s values indicated synonymous codon usage bias in the dUTPase gene of herpesviruses, and this synonymous bias was correlated with host evolution. The codon usage patterns of the DEV dUTPase gene were phylogenetically conserved and similar to that of the dUTPase genes of the avian alphaherpesvirus. Although codon usage in each microorganism was different, there were no strain-specific differences among them. Sixty-one codons in the predicted polypeptide, with a strong bias towards A and T at the third codon position, were used. Comparison of the codon usage in the dUTPase gene of different organisms revealed that there were 19 codons showing distinct codon usage differences between the DEV and Escherichia coli dUTPase genes; 16 between the DEV and yeast dUTPase genes; and 15 between the DEV and human dUTPase genes. Analysis of variance （ANOVA） showed significant differences between the DEV and yeast dUTPase genes （r = 0.536, P 〈 0.01）. The extent of codon usage bias in the DEV dUTPase gene was highly correlated with the gene expression level, therefore the results may provide useful information for gene classification and functional studies.     

3个茶树品种WOX基因家族的进化及密码子偏好性比较

【目的】WOX基因家族在模式植物组织培养中扮演着重要的分子调控角色。非模式植物WOX基因家族的系统发育和密码子使用偏好性研究有助于探索遗传进化规律和基因表达特征,进而为其转基因体系构建提供指导。【方法】利用生物信息学方法在3个茶树品种全基因组数据中鉴定WOX基因;通过ClustalX 2.1和MEGA X软件探索它们的进化规律。运用Perl语言、Codon W 1.4.2程序和SPSS 23.0等软件分析3个茶树品种WOX基因编码序列,探究它们的密码子使用偏好模式;基于ENc-GC_3s、PR2分析和中性分析结果解析影响密码子偏好的主要因素。【结果】共鉴定出42个WOX成员,其中‘云抗10号’(CSA)11个,‘舒茶早’(CSS)18个,‘云南野生古茶DASZ’(DASZ)13个,系统发育揭示3个茶树品种WOX基因在进化上存在较强的保守性。密码子偏好性分析揭示,3个茶树品种WOX基因密码子都偏好使用A/T和以A/T结尾;CSA和DASZ的WOX基因密码子使用模式相似,表明两者亲缘关系较近;以CSA和CSS作为转基因受体时,3个茶树品种WOX基因中个别密码子需优化;烟草是3个茶树品种WOX基因的最佳异源表达受体;ENc-GC_3s绘图、PR2分析和中性分析表明自然选择是影响3个茶树品种WOX基因密码子使用偏倚的主要因素。【结论】3个茶树品种WOX基因进化上较保守,密码子偏好使用A/T和以A/T结尾,且密码子偏好原因主要是自然选择;揭示出转茶树时密码子的优化信息和烟草为最佳异源表达受体的结果。     

Exploring Codon Usage Patterns of Alternatively Spliced Genes in Human Chromosome 1

Introduction A large number of species (prokaryotes and eukaryotes) have been used to study the pattern of codon usage bias, and it has also been demonstrated that inter- and intra-genomic variation of the pattern of codon usage is a widespread phenomenon, which may result from various factors. Alternative synonymous codon usage does not modify the amino acid sequence encoded in DNA among species and often among genes from the same genome. It has been suggested that the pattern of codon usag…     

用信息论方法研究几类核酸序列的密码子使用与基因表达水平的关系

研究了Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ和ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＹｅａｓｔ三类核酸序列的密码子使用频率与基因表达水平的关系，依照每一基因中最适密码子、非最适密码子和稀有密码子出现的概率，计算其信息熵Ｅ。首先，发现Ｅ与ＣＡＩ值保持了很好的线性关系，且三类序列的线性拟合方程非常接近，因此，用信息熵Ｅ作为描述基因表达水平的物理量是合适的；其次，三类序列的Ｅ─Ｐ（Ｒ）（稀有密码子概率）曲线都接近对数关系，说明稀有密码子在抑制基因表达水平方面，起着很重要的作用；第三，由各种关系曲线的相似性，可以推测，Ｅ．ｃｏｌｉ等原核生物与真核生物Ｙｅａｓｔ在密码子使用与基因表达水平的关系方面，其机理是相似的。     

利用RIG质粒在大肠杆菌中有效表达转录因子类蛋白

 大肠杆菌是常用的基因工程蛋白表达系统宿主菌,而密码子偏倚性常常成为某些异种蛋白质在大肠杆菌中成功表达的障碍.利用含有编码多种稀有tRNA的重组质粒RIG,一个含有大量稀有密码子的人类线粒体转录终止因子样蛋白成功地在大肠杆菌中得到表达.证明使用RIG质粒是克服大肠杆菌密码子偏倚性的有效手段.     

修饰合成冬鲽抗冻肽基因的设计和克隆

动物界和植物界密码子使用频率不同,冬Ｄｉｅ抗冻肽中丙氨酸占６０％而且偏爱ＧＣＣ,３８个Ａｌａ密友子中２３个为ＧＣＣ。我们设计合成抗冻肽基因时采用了植物基因常用密码子,用甘薯信号肽序列取了抗冻肽的ｐｒｅ序列,省略了Ｐｒｏ序列,并 信号肽下游二、四、八拷贝正向串联的成太的修饰基因,经测序证实与设计完成一致。利用ＱＩＡ表达系统,在大肠杆菌中实现了ＤＨＦＲ－成熟抗冻肽单体和二体的融合表达。     

Coevolution of codon usage and transfer RNA abundance

The use of synonymous codons is strongly biased in the bacterium Escherichia coli and yeast, comprising both bias between codons recognized by the same transfer RNA and bias between groups of codons recognized by different synonymous tRNAs. A major determinant of the second sort of bias is tRNA content, codons recognized by abundant tRNAs being used more often than those recognised by rare tRNAs, particularly in highly expressed genes, probably owing to selection at the level of translation against codons recognized by rare tRNAs. Conversely, codon usage is likely to exert selection pressure on tRNA abundance. Here I develop a model for the coevolution of codon usage and tRNA abundance which explains why there are unequal abundances of synonymous tRNAs leading to biased usage between groups of codons recognized by them in unicellular organisms.     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

分子伴侣GroEL对青霉素G酰化酶亚基折叠的影响

采用Tac启动子控制表达质粒，在不同的宿主细胞中表达了青霉素G酰化酶（PAC），检测这些菌株所表达的PAC活性，分析细胞内分子伴侣GroEL含量，PAC翻译后加工为α，β亚基的状况，以及它们之间的关系，结果表明：质粒pKK-SP在不同宿主中表达时，翻译后加工状况有明显差异，单位质量细胞所表达的PAC活性与翻译后加工效率相关，且与细胞内分子伴侣GroEL在菌体总蛋白中含量正相关，同时也阐明了亚基的折叠成为翻译后加工过程的限制步骤，细胞内分子伴侣GroEL有助于PAC亚基的折叠和稳定。     

Is there a close relationship between synonymous codon bias and codon-anticodon binding strength in human genes?

Synonymous codon bias has been examined in 78 human genes (19967 codons) and measured by relative synonymous codon usage (RSCU). Relative frequencies of all kinds of dinucleotides in 2,3 or 3,4 codon positions have been calculated, and codon-anticodon binding strength has been estimated by the stacking energies of codon-anticodon bases in Watson-Crick pairs. The data show common features in synonymous codon bias for all codon families in human genes: all C-ending codons, which possess the strongest codon-anticodon binding energies, are the most favored codons in almost all codon families, and those codons with medium codon-anticodon binding energies are avoided. Data analysis suggests that besides isochore and genome signature , codon-anticodon binding strength may be closely related to synonymous codon choice in human genes. The join-effect of these factors on human genes results in the common features in codon bias.