Pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆达和纯化

用PCR扩增嗜高温菌Pyrococctu furiosus的小分子热休克蛋白基因后,克隆于质粒pT7473中.该小分子热休克蛋白Pfu-sHSP含有较多的稀有密码子,在大肠杆菌BL21(DE),几乎无表达,而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA(arg)AGG(arg),AUA(ile)和CUA(leu)的BL21-Codonplus(DE)3-RIL中能大量表迭.大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后,离心沉淀用85℃水浴20 min,再离心,上清液再以Q Sepha-rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化,可以得到90%以上的蛋白.     

稻瘟菌MgCYP51B基因稀有密码子和mRNA二级结构分析与表达优化

在大肠杆菌中异源表达稻瘟菌CYP51(P450-14DM, MgCYP51B)基因,通过对MgCYP51B进行跨膜区预测和同源模建分析,并截短稻瘟菌CYP51B基因,构建了9种不同的重组表达质粒以实现蛋白表达.结果表明：只有pET28-MgB-83在3种宿主菌中实现了表达,且在BL21(DE3)pLysS中表达量最大.通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,发现稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构稳定性对MgCYP51B蛋白的表达都有影响,适用于稀有密码子表达的Rossetta(DE3)并不适用于MgCYP51B基因的最优表达.同时只有翻译起始区二级结构自由能最低的pET28-MgB-83才能实现表达.本研究实现了稻瘟菌MgCYP51B基因在大肠杆菌中的异源表达,证实密码子的偏爱性和翻译起始区二级结构稳定性影响MgCYP51B蛋白表达.     

Pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆表达和纯化

用PCR扩增嗜高温菌Pyrococcus furiosus的小分子热休克蛋白基因后，克隆于质粒p17473中．该小分子热休克蛋白Pfu－sHSP含有较多的稀有密码子，在大肠杆菌BL21（DE），几乎无表达，而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA（arg）AGG（arg），AUA（ile）和CUA（1eu）的BL21--Codonplus（BE）3－RIL中能大量表达．大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后，离心沉淀用85℃水浴20min，再离心，上清液再以Q Sepha—rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化，可以得到90％以上的蛋白．     

gfp融合的甲基对硫磷水解酶基因mph在E. coli中的表达

依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Pseudomonas sp. M6的有机磷水解酶基因mph设计合成了新的有机磷水解酶基因,然后将其与GFP融合进行表达,构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的mph-r基因全长927 bp,然后将基因克隆到p ET23a-gfp大肠杆菌表达型质粒上,成功构建了重组表达质粒p ET23a-gfpmph-r,转化大肠杆菌感受态Rosetta blue.经过诱导剂IPTG的低温诱导24 h后,收集细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测融合蛋白的表达.实验结果显示,融合蛋白的表达量大大提高,且通过酶活分析测定,全细胞酶活达到了11. 2 U/m L.     

伤寒沙门菌Mig-14蛋白部分密码子优化后的表达及多克隆抗体制备

通过原核表达Mig-14蛋白,制备相应多克隆抗体,用于后续Mig-14分子功能研究,为探寻Mig-14拮抗PB分子机制奠定基础.经密码子偏爱性分析显示mig-14基因含有8%的稀有密码子,综合考虑密码子偏好性、GC含量、限制性酶切位点等影响因素对密码子进行优化,重新合成mig-14基因,PCR获得周质空间部分,克隆至表达载体pET22b(+),并转入大肠埃希菌JM109中表达,KCl染色后切胶纯化的蛋白作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.Mig-14蛋白多克隆抗体的制备为后续免疫共沉淀研究Mig-14的作用蛋白奠定了基础.     

镰孢霉疫苗表达系统的构建及优化

镰孢霉(Fusarium venenatum)是一种具有高效表达和分泌蛋白质潜力的丝状真菌.本文探索以镰孢霉为表达宿主建立真菌蛋白表达系统.以含有Hyg抗性的pFGL59为出发质粒,分别利用真菌宿主里常用的强启动子PgpdA、PglaA和Ptrypsin构建整合型蛋白表达载体,并通过表达猪流行性腹泻病毒的中和表位蛋白COE,检测该系统的表达效率.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对工程菌株的胞外蛋白进行分析检测,结果显示在启动子Ptrypsin的驱动下,COE蛋白在镰孢霉工程菌中高效表达并分泌到胞外,而含有启动子PgpdA和PglaA的工程菌胞外蛋白中未检测到COE蛋白.根据镰孢霉密码子偏好性对coe基因的密码子进行优化后,COE蛋白在镰孢霉中的表达量得到显著提高.该疫苗表达系统的构建为疫苗蛋白在真菌宿主里的异源表达提供了新的方向.     

合成生物学新技术在基因表达精确调控和提高脂肪酸合成效率方面的应用

基因表达是生物体最重要的生理活动之一,而对基因表达进行精确的人工调控则是控制生物体蛋白合成以及生理活动的重要手段.上海交通大学国际基因工程机器大赛(InternationalGenetically Engineered Machine Competition,iGEM)团队自2009年参赛以来,多次应用合成生物学方法成功创建了稀有密码子开关、细胞膜支架和光控CRISPR干扰(CRISPRi)系统3种新型基因调控元件.通过在目的基因的起始密码子后插入合适数量的稀有密码子,对基因表达进行精确调节,调控一个多酶体系在最适化学计量比上进行反应;细胞膜支架可将目标蛋白固定在细胞内膜上,缩短不同蛋白之间的空间距离,加速酶催化反应速率;光控CRISPRi系统则创新性地将生物感光系统与新兴的CRISPRi技术相结合,通过光信号在转录水平上精确调控生物体内源基因的表达.这3项新技术在大肠杆菌脂肪酸合成方面均得到了成功的应用,从而提高了脂肪酸的合成量和分泌效率.     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.     

番茄ACC合酶(LeACS2)在大肠杆菌中的可溶性表达

植物激素乙烯参与了植物生长发育等一系列生理过程,通过控制乙烯的合成进而控制经济作物的衰老和果实的成熟,给农业带来深远影响.ACC合酶是高等植物乙烯生物合成的限速酶.通过RT-PCR将番茄ACC合酶(LeACS2)cDNA克隆至大肠杆菌表达载体pET30a中并使之与GST 编码序列进行融合而构建了重组表达质粒pET-LeACS2-GST.转化获得含有该重组表达质粒的大肠杆菌BL21 starTM(DE3) pLysS细胞,在IPTG的诱导下成功表达出含有LeACS2的大小约83 000的融合蛋白.该融合蛋白具有较好的可溶性.通过GST亲和层析和MonoQ阴离子交换两步纯化后的LeACS2能够催化其底物SAM生成ACC.     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ,并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下,ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。     

Pseudomonas koreensis JDM-2株ACC脱氨酶基因的克隆和表达

应用PCR从杜仲内生Pseudomonas koreensis JDM-2株基因组中扩增出ACC脱氨酶基因acdS,将其克隆到pMD18-T载体并段进行DNA测序,通过BamHⅠ和HindⅢ酶切从重组质粒pMD18ACDS中切下acdS基因序列,将其连接到pQE30质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点,构建表达质粒pQE30ACDS,转化大肠杆菌BL21,利用比色法测定ACC脱氨酶活力.测序结果表明,JDM-2菌株acdS基因大小为1 017 bp,与已报道不同菌种acdS基因的同源性在86％～99％之间.SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中表达了分子量为38 kDa的ACC脱氨酶.酶活性检测结果显示重组菌ACC脱氨酶的酶活力为0.214 U/mg.     

修饰合成冬鲽抗冻肽基因的设计和克隆

动物界和植物界密码子使用频率不同,冬Ｄｉｅ抗冻肽中丙氨酸占６０％而且偏爱ＧＣＣ,３８个Ａｌａ密友子中２３个为ＧＣＣ。我们设计合成抗冻肽基因时采用了植物基因常用密码子,用甘薯信号肽序列取了抗冻肽的ｐｒｅ序列,省略了Ｐｒｏ序列,并 信号肽下游二、四、八拷贝正向串联的成太的修饰基因,经测序证实与设计完成一致。利用ＱＩＡ表达系统,在大肠杆菌中实现了ＤＨＦＲ－成熟抗冻肽单体和二体的融合表达。     

结核杆菌19ku脂蛋白的表达与纯化

目的:通过基因工程技术获得重组结核分枝杆茵19 ku蛋白。方法:应用PCR技术扩增卡介苗的19 ku蛋白DNA序列;以质粒pET28a为表达栽体,构建19 ku重组质粒,然后转化大肠埃希菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。通过镍柱纯化后获得目的蛋白。结果:重组质粒pET28a-p19测序表明与报道的序列相同。它在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆茵l9 ku蛋白诱导4 h在大肠埃希菌中的表达量最高。结论:pET28a-p19大肠埃希菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19 ku蛋白。     

磺基水杨酸的分子内质子转移及其在酸性锡电镀液中的荧光快速测定

根据磺基水杨酸反常大的荧光Ｓｔｏｋｅｓ位移的实验现象，提出了它在一定条件下发生分子内质子转移的机理．据此建立了酸性锡电镀液中磺基水杨酸的直接快速荧光分析新方法．该方法不受共存组分干扰，５～１０ｍｉｎ可完成测定，测定的相对标准偏差小于３％．     

Identification and expression of a gfpK79R mutant of green fluorescent protein

A mutant strain of E.coli showing strong green fluorescence is obtained during the study of cloning and expression of blue fluorescent protein gene bfp. A recombinant plasmid pHN122 has been isolated. It is demonstrated by enzyme digestion, subcloning and sequence analysis that it contains both of bfp and gfpK79R mutant genes. The results of spectrometric analysis show that GFPK79R expressed by pHN122 is the same as the wild type GFP, but its fluorescent intensity is increased 1.25～2.44-fold.     

检测汞的全细胞生物传感器构建

汞（Hg）是环境中主要的重金属污染物,暴露于环境中的汞对人体健康有严重危害。汞的精确检测对控制环境污染和减少对健康的危害有着重要意义。该实验是基于MerR蛋白调节的启动子对应答汞毒性基因的调控机理,首先通过试验确定红色荧光蛋白mCherry为报告基因。将MerR基因片段链接到质粒pUC57得到质粒pUC57-MerR,以其为模版得到质粒pUCRR,转入到E. coli DH5α中,得到工程菌株E. coli UCRR。为提高菌株的性能和灵敏度,通过易错PCR技术获得MerR基因突变体库,筛选出菌株V109E在培养4 h时,荧光信号强度远远高于其他菌株荧光信号,对Hg2＋有高度专一性,检测Hg2＋的最低浓度为0.5nM。