Pyrococcus furiosus小分子热休克蛋白Pfu-sHSP的克隆表达和纯化

用PCR扩增嗜高温菌Pyrococcus furiosus的小分子热休克蛋白基因后，克隆于质粒p17473中．该小分子热休克蛋白Pfu－sHSP含有较多的稀有密码子，在大肠杆菌BL21（DE），几乎无表达，而在带有大肠杆菌稀有密码子AGA（arg）AGG（arg），AUA（ile）和CUA（1eu）的BL21--Codonplus（BE）3－RIL中能大量表达．大量表达Pfu-sHSP蛋白的细胞用超声波破碎后，离心沉淀用85℃水浴20min，再离心，上清液再以Q Sepha—rose Fast Flow阴离子交换和S-200凝胶过滤层析进一步纯化，可以得到90％以上的蛋白．     

稻瘟菌MgCYP51B基因稀有密码子和mRNA二级结构分析与表达优化

在大肠杆菌中异源表达稻瘟菌CYP51(P450-14DM, MgCYP51B)基因,通过对MgCYP51B进行跨膜区预测和同源模建分析,并截短稻瘟菌CYP51B基因,构建了9种不同的重组表达质粒以实现蛋白表达.结果表明：只有pET28-MgB-83在3种宿主菌中实现了表达,且在BL21(DE3)pLysS中表达量最大.通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,发现稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构稳定性对MgCYP51B蛋白的表达都有影响,适用于稀有密码子表达的Rossetta(DE3)并不适用于MgCYP51B基因的最优表达.同时只有翻译起始区二级结构自由能最低的pET28-MgB-83才能实现表达.本研究实现了稻瘟菌MgCYP51B基因在大肠杆菌中的异源表达,证实密码子的偏爱性和翻译起始区二级结构稳定性影响MgCYP51B蛋白表达.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

植物乳杆菌Lactobacillu plantarumY1菌株胆盐水解酶基因(bsh)的克隆及重组表达

经同源蛋白比对分析设计引物,PCR 扩增获得植物乳杆菌Y1菌株bsh基因(975bp),首先克隆至表达载体pET-28a,转化E. coli BL21(DE3)菌株,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示表达的重组蛋白为包涵体.选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA 的E. coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,仍旧没有改善表达产物的可溶性.但是,选择含IF2融合蛋白标签的pLS-IF2质粒构建表达载体,SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定结果显示表达的融合重组蛋白IF2-BSH具有可溶性.该结果为进一步研究乳酸菌胆盐水解酶的生物活性,结构功能关系的研究奠定了基础.     

蜂毒素-SP94杂合基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

用可以特异结合到肝癌细胞膜上的小肽SP94,与蜂毒素连接,构建重组表达载体pET32a-蜂毒素-SP94.转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达结果,产物经Ni-NTA Agrosc亲和层析柱纯化后进行Tricine-SDS-PAGE检测.重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,约占细胞总蛋白...     

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。     

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入融合基因表达载体pET17bBamHⅠ位点,构建成重组质粒pETK23,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,纤溶酶原kringle5功能区基因在重组转化菌株BL21(DE3,pETK23)中获得高效表达,表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白的528%.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

人源抗菌肽LL-37原核表达载体的构建及表达

为了使人源抗菌肽LL-37在原核表达载体中获得高效表达,在不改变LL-37氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏爱密码子表,替换LL-37部分密码子,设计一段新的LL-37序列.采用DNA Work设计4条互补引物,利用SOE-PCR技术扩增完整的LL-37目的片段,以pET-PPPI为载体,构建原核表达载体pET-PPPIL,并制备表达菌BL21(DE3)(pET-PPPIL),该菌经诱导高效表达LL-37融合蛋白,为后续纯化LL-37奠定了基础.     

B型产气荚膜梭菌β毒素的表达与纯化

将构建好的表达产气荚膜梭菌β毒素的重组质粒pET-32a-β转化大肠杆菌BL21(DE3),将得到的重组菌株BL21(DE3)(pET-32a-β)用IPTG进行诱导表达,探究其最佳诱导时间.对所表达的β毒素包涵体进行变性、纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性蛋白,动物免疫实验取得了良好的结果,为下一步抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体和单链抗体的研究奠定基础.