肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

生物转化法重组谷氨酸脱羧酶合成γ-氨基丁酸

成功构建了一个高效表达大肠杆菌谷氨酸脱羧酶GAD来源的重组质粒pET28a-gadA,并转化E.coli BL21(DE3),工程菌株经0.4mmol/L IPTG或1g/L的乳糖, 37℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到12U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的60倍.工程菌1.15U粗酶液以31g/L L-谷氨酸钠为底物, 37℃、pH 4.0条件下反应4h,γ-氨基丁酸的生成量达到19.57g/L, L-谷氨酸钠的转化率为93%,从而为γ-氨基丁酸的生产提供了很好的前景.     

秀丽隐杆线虫胆固醇7,8-脱氢酶在大肠杆菌中的表达

胆固醇7,8–脱氢酶是参与胆固醇代谢的还原酶,可以将胆固醇转化为7–脱氢胆固醇(合成维生素D3的重要中间体).合成秀丽隐杆线虫的胆固醇7,8-脱氢酶基因daf-36,与具有T7强启动子的载体pET32a(+)连接后,成功构建pET32a-daf-36表达质粒,转入大肠杆菌表达系统E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta(DE3),经过IPTG诱导培养,蛋白质电泳图谱及质谱结果表明此酶得到了高效表达.     

λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

λ噬菌体切除酶Xis(excisionase)是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质.通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Xis在体外合成,然后克隆到带有类泛素蛋白SUMO标签的定向原核表达载体SUMO-p ETG上,测序正确后,然后转化至E.coli BL21(DE3)细胞可溶性表达.经SDS-PAGE及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白.该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Xis不仅解除了Xis对E.coli宿主细胞的毒害作用,而且实现在E.coli中的高水平可溶性表达.因此,Xis的大量制备,将会促进Gateway克隆技术的广泛应用.     

微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

小鼠H-2D~b-BSP融合基因的构建与表达

目的:构建小鼠H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌中表达.方法:采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Db链的胞外段基因,经双酶切置换已构建的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列,使H-2Db与BirA酶底物肽(BSP)序列融合,构建H-2Db-BSP融合基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导融合蛋白表达.结果:构建的H-2Db-BSP融合基因插入正确且序列与GenBank一致;经1mmol/L浓度的IPTG诱导后4h蛋白表达达到高峰,且融合蛋白以包涵体形式存在.结论:成功构建H-2Db-BSP融合基因,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步构建H-2Db四聚体,研究T细胞应答提供了物质基础.     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

蛋白磷酸酶2C（PP2C）的表达、 纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA, 经RT PCR, 扩增出蛋白磷酸酶2C（PP2C）基因, 并构建了pUCm T载体. 经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后, 将pUCm T中的PP2C基因插入pET28a载体中, 构建了表达载体pET28a PP2C, 并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达. 经测定, 该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为： 诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L, 37 ℃, 诱导时间为20 h. 在此条件下, PP2C实现了高 效表达, 表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%, 其中在裂解上清液、 沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%. 经SDS PAGE分析, 表达产物分子量约为42 000. 应用Ni NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化, 收率达805%, 纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据 GenBank 中 NDP kinase 的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成 NDP kinase 基因,构建原核表达载体 pET28a-NDP kinase 并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后 NDP kinase 基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中该基因经 IPTG 诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95;以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶（NDP kinase）基因的 pET28a 原核重组质粒,为进一步研究 NDP kinase 在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析

通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因，分别克隆到原核表达载体pET21a，pET32a和pGEX-4T-1中，将3种重组质粒pET2la-N，pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白，表达量分别达总蛋白的45％、40％和30％．进一步的分析表明：6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达，该可溶性组分占细菌裂解液的70％左右，且能被6xHis抗体所识别．用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测．SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能．     

大鼠肌肉素cDNA克隆及表达

通过RT-PCR方法从大鼠骨骼肌中克隆到肌肉素cDNA,构建表达载体pGEX-5X-3-musclin,并在BL21大肠杆菌中成功表达了融合蛋白GST-Musclin,且对表达条件进行了优化.在最优化的表达条件下,融合蛋白的表达量达到了14.2%.     

重组人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A蛋白的可溶性表达、纯化和对肿瘤细胞的抑制活性

以人促性腺激素-铜绿假单胞菌外毒素A衍生物（GnRH-PE39KDEL）为研究对象,根据大肠杆菌密码子偏好性优化,通过基因合成的方法获得重组蛋白核酸序列,连接至pET-24b载体中,并转化入大肠杆菌BL21 (DE3)及BL21 ( DE3) plyS中进行诱导表达。结果显示,在含有2 mg/mL葡萄糖的LB培养基中37 ℃培养至OD-600约为0.6 h,加入0.2 mmol/L IPTG在30 ℃诱导2 h后,重组蛋白可以实现可溶性高表达。工程菌经超声波破碎、高速离心后,经镍柱纯化和脱盐后得到重组蛋白,蛋白纯度达到95 %以上,蛋白最终得率在2.6 mg/g菌体。重组蛋白经IC-50检测,可以较好地抑制肿瘤细胞株的生长。