PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(TSHR)蛋白的融合表达及鉴定

为表达青岛文昌鱼促甲状腺激素受体(the thyrotropin receptor,TSHR),构建了TSHR基因的原核表达载体pGEX-4T-1-TSHR,并将其转化入大肠杆菌DH5α中.采用IPTG诱导蛋白表达,并用SDS-PAGE分析表达蛋白.利用抗TSHR多克隆抗体进行Western blot检测.结果表明重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达,融合蛋白的分子大小约为76kDa,Western blot检测说明得到的融合蛋白为TSHR蛋白,成功构建了文昌鱼TSHR基因的原核表达载体.     

结核杆菌19ku脂蛋白的表达与纯化

目的:通过基因工程技术获得重组结核分枝杆茵19 ku蛋白。方法:应用PCR技术扩增卡介苗的19 ku蛋白DNA序列;以质粒pET28a为表达栽体,构建19 ku重组质粒,然后转化大肠埃希菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。通过镍柱纯化后获得目的蛋白。结果:重组质粒pET28a-p19测序表明与报道的序列相同。它在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆茵l9 ku蛋白诱导4 h在大肠埃希菌中的表达量最高。结论:pET28a-p19大肠埃希菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19 ku蛋白。     

GST—hBTLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBTLyS（human Blymphocte stimulator）基因序列设计合成特异性引物。用RT－PCR从人外周血淋巴细胞扩增出858bp的hBLyS基因，并将其插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中，得到重组表达质粒pGEX-4T-1/hBLyS.把此重组质粒转化大肠杆菌BL21，经用IPTG诱导，表达出GST－hBLyS融合蛋白。     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

质粒pGEX-4T-2在表达宿主菌中的分离稳定性

为了寻找影响质粒pGEX-4T-2在表达宿主菌中分离稳定性有关的因素及水平,将质粒pGEX-4T-2转化到表达宿主菌JM109中.挑取单克隆后培养过夜,10%量接种培养,5h后将菌液稀释106倍后等量的分别涂布到LB和LA固体培养基中,37℃培养过夜后数其菌落数,二者相比得到分离稳定率.数据分析采用F-检验,多重比较采用LSR法及Q法.经统计学处理,抗生素的浓度,培养温度以及它们的交互作用对质粒pGEX-4T-2在表达宿主JM109中的分离稳定性均有显著性的影响,并且随着抗生素的浓度的提高质粒pGEX-4T-2在表达宿主JM109中的分离稳定性有提高的趋势.     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

pPET-SUMF2各亚型的原核质粒构建及蛋白表达

构建人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因各亚型的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达pPET-SUMF2各亚型的融合蛋白。用EcoRI和XhoI双酶切人SUMF2各种亚型基因及质粒pPET-30a;将2种酶切产物按常规方法连接、转化至大肠杆菌DH5α。挑取菌落培养,提取质粒进行验证。将构建成功的pPET-SUMF2各亚型重组表达质粒转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析以及Western blot检测SUMF2各亚型的融合蛋白表达。成功构建了pPET-SUMF2各亚型的重组表达质粒,并成功诱导SUMF2各亚型融合蛋白的表达,Western blot结果显示在预期位置有特异蛋白条带表达,并在BL21(DE3)内表达了SUMF2各亚型的融合蛋白,为进一步研究SUMF2的功能以及SUMF2与哮喘发病的关系奠定了基础。     

大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.     

矢车菊素-3-葡萄糖苷抑制环氧丙酰胺诱导的MDA-MB-231细胞内谷胱甘肽的降低

为探讨食源性成分降低丙烯酰胺及主要致毒代谢物环氧丙酰胺对人体的危害作用,利用比色法、酶活性检测及免疫分析等方法,从细胞谷胱甘肽及其相关酶解毒的角度,研究了不同浓度的矢车菊素-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺引起的人类乳癌细胞MDA-MB-231毒性的影响. 结果表明,与环氧丙酰胺单独处理的细胞相比,矢车菊素-3-葡萄糖苷预处理后,能够显著降低细胞毒性及胞内活性氧水平,明显提高细胞内还原型谷胱甘肽含量,抑制谷胱甘肽过氧化物酶与谷胱甘肽S转移酶活性的升高,并且提高两种酶的蛋白表达量. 矢车菊素-3-葡萄糖苷对环氧丙酰胺引起的MDA-MB-231细胞毒性具有明显的抑制作用.      

饲料添加剂硒和谷胱甘肽对微囊藻毒素胁迫下罗非鱼肝脏去毒相关基因诱导表达的影响

为从分子水平探讨饲料添加剂硒(Se)和谷胱甘肽(GSH)对淡水养殖鱼类肝脏微囊藻毒素胁迫下去毒分子机理的影响,实验杂交罗非鱼一组喂食含0.15 mg/kg Se的富硒酵母粉饲料,一组喂食含普通酵母粉的饲料,喂食一个月以上;实验尼罗罗非鱼一组喂食含1 g/kg GSH的饲料,一组喂食普通饲料,两组均饱食10 d.所有实验组再均分两组,一组腹腔注射磷酸缓冲液(PBS),一组按体质量注射腹腔注射50μg/kg微囊藻毒素-LR(MC-LR),24 h后分离肝脏组织.以β-肌动蛋白作为外参照,采用半定量RT-PCR方法研究Se和GSH分别对罗非鱼肝脏去毒相关基因转录水平的诱导改变.结果表明,未喂食Se的实验组,杂交罗非鱼肝脏alpho-可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGSTA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)基因mRNA表达水平在腹腔注射50μg/kg MC-LR 24 h后,均较PBS组有诱导趋势;Se+MC-LR组sGSTA和GPX基因mRNA表达水平,均较Se+PBS组略低,可能与添加剂的低剂量添加相关.喂食GSH的实验组,尼罗罗非鱼腹腔注射MC-LR组,肝脏sGSTA基因mRNA表达水平较PBS组有诱导趋势;Se+MC-LR组GPX基因mRNA表达水平,较Se+PBS组有升高趋势,而sGSTA和rho-可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGSTR)基因mRNA表达水平则轻微降低.本实验首次从基因表达水平比较研究了Se和GSH对罗非鱼微囊藻毒素压力情况下,肝脏去毒酶基因表达的影响变化,为Se和GSH饲料添加剂在鱼类饲料中的合理添加提供分子水平的理论依据.     

谷胱甘肽过氧化物酶的研究

本文从组织细胞学分布、分子结构、分离纯化、酶学特性、硒的生物学作用诸方面,对谷胱甘肽过氧化物酶的现况予以综述,同时也阐明了该酶的生物学作用及应用前景.     

植物对臭氧的防御机制及其定量化研究进展

本文首先简要回顾了臭氧评估模型的发展历程,在明确了现有评估模型在模拟植物自身防御的局限性的基础上,从气孔调节、抗氧化剂解毒和植物自身修复三个方面对植物的防御机制进行概述。归纳出主动防御和被动防御的概念,并总结了定量化植物防御机制的研究进展,提出了臭氧评估模型的发展趋势。指出：加强解毒模型的研究结合现有通量模型构建基于气孔吸收和植物解毒的评估模型是当前臭氧评估的必然趋势;开展非气孔吸收通量和冠层通量的研究,实现从叶片尺度到冠层尺度的扩展,是臭氧胁迫效应研究的未来发展方向。     

硒与人体健康

本文主要论述了硒在人体内的吸收和排泄 ,它的主要生理功能和缺乏所引起的病症 ,以及如何补硒     

含硫树脂的制备及在谷胱甘肽分离中的应用

利用大孔苯乙烯树脂改性合成含硫树脂,考察了修饰条件对谷胱甘肽吸附的影响。并对其在谷胱甘肽分离中的应用进行了研究。结果表明采用pH3.0的缓冲液进行吸附,自制的含硫树脂最大吸附容量可达22mg/g湿树脂,选择质量浓度为0.5%的NaOH溶液洗脱GSH,解吸率可达70%以上。采用真实发酵液进行分离纯化,收率为35%,纯度可达90%以上。     

谷胱甘肽自组装膜修饰电极用于Cr(VI)离子的测定

将谷胱甘肽(GSH)自组装膜修饰电极用于Cr(Ⅵ)的测定.实验表明,在0 02mol/LH2SO4 0 1mol/LNaNO3溶液中,在 1 00～-0 40V电位范围内进行循环伏安扫描,于 0 29V(Vs.SCE)处获得铬的还原峰信号、 0 65V(Vs,SCE)处获得铬的氧化峰信号.Cr(VI)在GSH/Au修饰电极上的电化学行为比裸金电极有明显的改善,峰电流更为灵敏,且还原峰电流随着Cr(VI)浓度的增加而增大,因此选择 0 29V的还原峰作为分析信号,运用1 5次微分线性扫描伏安法对铬进行了定量分析,线性范围为1 0×10-8～1 0×10-6mol/L,检测限为1 0×10-9mol/L.将所建立的方法应用于湖水样品中铬含量的测定,以ICP进行对照实验,结果满意.     

发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定方法的改进及其比较

谷胱甘肽是生物体内一种具有重要生理功能的活性三肽,文中改进并比较了三种简单快速测定还原型谷胱甘肽的比色法———四氧嘧啶法、亚硝基铁氰化钠法和DTNB法。四氧嘧啶法和DTNB法的精确度要好于亚硝基铁氰化纳法,并且能够避免半胱氨酸等含巯基化合物的干扰,相对标准偏差可以控制在4%以内。     

谷胱甘肽在水产养殖中的应用研究进展

谷胱甘肽（glutathione,GSH）是含有巯基的三肽,广泛存在于生物组织中,作为良好的抗氧化剂、解毒剂和免疫增强剂,对于水产养殖业意义重大。谷胱甘肽的研究为水产养殖新饲料的开发提供了理论依据,具有重要的理论意义和实际应用价值。本文综述了谷胱甘肽在水产养殖动物生长发育、抗氧化、解毒等方面的研究进展。     

运动训练对人体血清中ROS、GSH、GSH—PX影响的研究

为了探讨了有氧运动训练和无氧运动训练对人体在不同功能状态下活性氧（ROS）生成及其清除体系中还原型谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）活性的影响，分别对12名从事有氧运动训练和12名从事无氧运动训练的高水平运动员及其12名普通大学生进行了相关指标测试，结果发现：安静状态时，有氧训练组的GSH含量明显低于无氧训练组和对照组（P＜0．05），ROS，GSH－PX活性无组间差异（P＞0．05）；定量负荷后3项指标均无组间明显差异（P＞0．05）；力竭性运动后，有氧训练组GSH含量又明显低于无氧训练组和对照组（P＜0．05），而GSH－PX活性则显著高于无氧训练对机体ROS代谢水平无明显影响，有氧训练能有效降低血清中GSH含量，提高机体力竭性运动后血清中GSH－PX的活性，其机理尚不清楚。