盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+-GPD基因的生物信息学分析

盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是极端耐盐的单细胞真核绿藻,依赖于NAD的3－磷酸甘油脱氢酶（NAD+-GPD）是盐生杜氏藻调渗物质——甘油合成的关键酶.盐生杜氏藻NAD+-GPD基因是第一个被发现含双结构域（SerB和GPD）的GPD基因.而双结构域可能是盐生杜氏藻具有极强耐盐性和快速合成甘油的关键.通过与莱茵衣藻基因组数据库比对,发现莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

盐生杜氏藻和衣藻双结构域NAD+GPD基因的生物信息学分析

将盐生杜氏藻(Dunaliella salina)双结构域(SerB和GPD)3-磷酸甘油脱氢酶基因(NAD+-GPD)序列与莱茵衣藻全基因组进行比对,发现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中也存在具有SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因序列.在对两个物种NAD+-GPD基因的基因结构、mRNA组成成分、编码蛋白及其理化性质和编码蛋白结构的分析中,发现二者具有较高的相似性.针对目前仅在盐藻和衣藻中发现含SerB和GPD结构域的NAD+-GPD基因这一现象,分别对SerB和GPD结构域同源基因的系统进化进行了分析.     

杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心蛋白D2 基因的克隆及序列分析

根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Oryza sativa、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride 等真核生物的psbD基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到杜氏盐藻cDNA片段的长度大约为1 000bp.该序列的PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列,Blast同源性分析表明所克隆的基因为杜氏盐藻psbD基因,编码杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心D2蛋白,该序列已递交GenBank(GenBank登录号为:DQ074450).编码的氨基酸序列,同源性依次为:Chlamydomonas reinhardtii 92%,Nephroselmis olivacea 88%,Pinus thunbergii 88%,Amborella trichopoda 88%,Chlorella vulgaris 88%.通过密码子偏爱性分析表明,psbD基因存在明显的密码子偏爱性,其(A T)含量明显高于(G C)含量.     

紫外辐射对盐藻SZ-05的胞外多糖和β胡萝卜素产量的影响

研究紫外辐射对盐藻空间诱变株系SZ-05(Dunaliella salina SZ-05)胞外多糖及β胡萝卜素积累的影响.实验显示,紫外辐射后盐藻SZ-05的细胞密度明显降低,β胡萝卜素的产量显著提高,胞外多糖的产量也略有增加.结果表明,氧化胁迫能提高盐藻SZ-05的胞外多糖和β胡萝卜素的含量.     

杜氏盐藻(Dunaliella salina)对重金属铜胁迫的生理响应

将不同质量浓度的CuCl_2溶液添加到培养基中,研究重金属铜对杜氏盐藻(Dunaliella salina)胁迫的生理响应.分别用不同质量浓度的CuCl_2溶液培养盐藻,检测盐藻的光合色素、可溶性多糖、蛋白质、SOD及MDA质量浓度的变化.结果显示,铜可抑制盐藻细胞的生长,且呈剂量-效应关系,72 h的EC50为9. 55 mg/L.随着铜质量浓度的增加,各质量浓度组盐藻细胞内叶绿素a、b、总叶绿素、类胡萝卜素、多糖和蛋白质质量浓度均显著性降低(P 0. 05或P 0. 01).铜可导致盐藻细胞氧化损伤,随着铜质量浓度的升高,SOD活力先升高后降低,MDA质量浓度升高.表明铜可以抑制盐藻细胞内光合色素、多糖和蛋白质的合成.盐藻对铜胁迫的响应机制可能是通过抗氧化防御系统.     

氮、磷、硫对盐生杜氏藻色素积累的影响

研究了盐生杜氏藻(Dunaliella salina)在不同浓度氮、磷、硫等营养条件下对细胞积累β-胡萝卜素和叶绿素的影响．发现盐生杜氏藻细胞经过10d生长,在营养缺乏条件下其β-胡萝卜素和叶绿素的比率达到最大,积累β-胡萝卜素的最适条件是无氮、无磷和无硫,但是不利于盐生杜氏藻的生长．讨论了此结果的机理和意义,为利用盐生杜氏藻大规模生产β-胡萝卜素提供了理论依据．     

盐生杜氏藻的完整叶绿体分离

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是世界上最耐盐的一种单细胞真核绿藻,可在含0．1～5．0mol／L NaCl的培养液中正常生长．盐生杜氏藻细胞内的主要调渗物质是甘油,在甘油代谢途径中,3-磷酸甘油脱氢酶是一个关键酶．近年来的研究表明杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)细胞质和叶绿体中都存在3-磷酸甘油脱氢酶的同工酶,且叶绿体上的同工酶与渗透调节作用直接相关,为了解D．satina中3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的细胞定位和分布,我们通过冰浴超声波破碎和蔗糖密度梯度离心,获得盐生杜氏藻的完整叶绿体,用相差显微镜镜检、酶的活性分析等方法对其完整性作了初步分析。     

温度对杜氏藻生长和脂肪酸组成的影响

研究了不同温度对盐生杜氏藻(Dunaliella.salina)生长及脂肪酸组成的影响.结果表明:在20～32℃之间,提高培养温度和增加光照强度促进了盐生杜氏藻的生长;盐生杜氏藻的脂肪酸组分以C16和C18脂肪酸为主,随着培养温度的升高和光照强度的增加,藻株内饱和脂肪酸所占百分比例增加,多不饱和脂肪酸所占百分比例减小.     

杜氏藻种间关系RAPD分析

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对7株杜氏藻,即：D.salina、D.bardawil、D.minuta、D.bioculata、D.parva、D.peircei和D.primolecta进行了遗传多态性分析。用30个10聚随机引物进行多态性扩增和筛选,其中23个引物（76.67%)可获得清晰的多态性条带。选择其中能够得到清晰、重复性良好的18个引物共扩增产生150条可区分的DNA条带。根据种间Nei遗传相似系数计算分析,构建杜氏藻属部分种的聚类分析图。分析结果表明：D.salina、D.bardawil和D.minuta聚为一类,D.bioculata、D.parva、D.peircei和D.primolecta聚为另一类。由于两类之间存在较远的亲缘关系,把这两类杜氏藻称为两个种可能更合适。     

过氧化氢对不同光质下盐藻SZ-05生长及代谢产物积累的影响

研究不同浓度的过氧化氢对在不同光质(白、红、黄、蓝光)下生长的杜氏盐藻SZ-05(Dunaliella salina SZ-05)生长与代谢产物积累的影响.结果表明,当过氧化氢浓度从10-6 mol·L-1增至10-4 mol·L-1时,对盐藻的生长有微弱的促进作用,各种光质培养条件下盐藻的细胞密度均逐渐增大至最大值,其中红光下的盐藻细胞密度最大,为6.19×106 ml-1;当过氧化氢的浓度增加到10-3 mol·L-1时,细胞密度减小,表现为抑制作用.在过氧化氢浓度为10-6 mol·L-1时,不同光质培养条件下盐藻的单个细胞内β胡萝卜素的含量均达到最大值,其中红光单个细胞内的β胡萝卜素的含量最大,为0.790 pg.当过氧化氢浓度继续增加时,单个细胞内β胡萝卜素的含量降低,表现为抑制作用.在过氧化氢浓度为10-3 mol·L-1时,红光条件下生长的盐藻胞外多糖含量获得最大值,为5.97 pg.     

坛紫菜PhGME基因克隆及差异表达分析

GDP-甘露糖-3,5-表异构酶(GME)是抗坏血酸合成过程中的关键限速酶.以坛紫菜(Pyropia haitanensis)转录组测序获得的unigene序列为基础,采用普通PCR技术克隆获得了坛紫菜编码GME的基因序列PhGME.序列分析结果表明,PhGME基因序列全长1411 bp,包含一个1260 bp的开放阅...     

小盐芥(Thellungiella salsuginea)CBF1基因的克隆

CBFs （ CRT/DRE-binding factor ）是结合DNA顺式元件CCGAC的转录因子．拟南芥中CBFs由一个小的基因家族编码,包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3,它们在植物抗逆性调控中起重要作用．为了获得高度耐盐耐旱的转基因植物,我们以盐生植物小盐芥为材料,依据拟南芥中CBF1的序列信息设计引物,扩增出小盐芥中CBF1的部分序列,然后使用SMART^TM RACE等方法,从小盐芥中克隆到全长的CBF1 cDNA序列,进而重组到植物表达载体中,为植物抗逆基因工程提供了有用基因．     

黑鲷NKCC1分子特征及其对急性盐度胁迫的表达响应

为了解黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)在盐度胁迫过程中的适应机制,本研究利用基因扩增、聚类分析、荧光定量PCR等技术对NKCC1基因进行生物信息学分析以及在不同组织中的表达特征研究,并探讨其在急性盐度胁迫下的表达机制。结果表明NKCC1基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)为3 504 bp,共编码1 167个氨基酸,预测蛋白分子量为127.19 kDa,理论等电点为5.75。结构域分析表明黑鲷NKCC1分子为跨膜蛋白,并包含一个典型的Na~+-K~+-Cl~-共同转运蛋白SLC12A结构域,且在不同物种中具有很高的保守性;序列比对分析表明黑鲷NKCC1氨基酸序列与金头鲷NKCC1a的同源性最高,为97.8%;组织表达分析表明黑鲷NKCC1基因在所检测的12个组织,即肝脏、肾脏、心、脑、眼、鳃、鳍条、脾脏、皮肤、肠、性腺和白肌中均有表达,其中在肾脏、鳃和肠中表达量最高,并显著高于其他组织(P0.05);在低盐度胁迫下,NKCC1基因在鳃组织中的表达量对盐度变化响应十分迅速,而在肾脏组织中,低盐度和高盐度胁迫都会在不同时间点抑制NKCC1基因的表达量。综上所述,本研究为解析NKCC1基因在黑鲷调节渗透压和离子平衡过程中的功能机制奠定了基础,并为促进黑鲷养殖产业的可持续发展提供一定的技术理论。     

白桦BpGT14基因表达模式及对非生物 胁迫诱导的响应

为了揭示BpGT14基因的分子结构特征,明确糖基转移酶BpGT14基因的表达模式及其对非生物胁迫的响应机制,初步探索其在白桦生长发育中的功能,在克隆白桦GT14基因全长序列的基础上,利用生物信息学对其理化性质进行了分析,应用实时荧光定量PCR技术分析BpGT14基因在野生白桦植株雄花序、木质部、韧皮部及叶片4个不同部位不同月份的表达差异; 同时,选用白桦茎段悬浮细胞进行了水杨酸(SA)、盐胁迫(NaCl)、重金属镉(CdCl₂)及4℃低温非生物胁迫处理,检测目的基因对逆境的响应情况。研究结果表明,BpGT14基因开放阅读框为1 302 bp,编码433个氨基酸。分析其氨基酸序列发现,该蛋白含有乙酰氨基葡糖转移酶结构域,属于14家族的重要结构域。该蛋白与其他物种GT14蛋白比对分析表明,这些蛋白在100—350氨基酸区域内保守性较高,而且该基因与毛果杨的GT14家族基因同源性高达79%。不同部位不同月份的表达模式分析结果表明,BpGT14基因的表达具有部位及时间特异性,其各部位表达量均与月份相关,同时发现其在木质部、韧皮部及叶片中的表达量较高,而在雄花序中表达量较低。非生物胁迫处理结果显示,BpGT14基因对不同处理均产生响应,但其响应模式不尽相同:SA、CdCl₂及低温处理结果显示,处理初期(6 h)目的基因上调表达,6 h处理时分别达到了对照组的51.2、48.9及3.3倍,24 h后相对表达量与对照组相比均下调,只有低温处理在96 h恢复上调表达; NaCl处理使白桦BpGT14基因的表达量全部呈现下调趋势,24 h处理后,BpGT14基因表达量下调明显,24 h后比对照组降低了93.7%。     

欧洲山杨bHLH转录因子家族全基因组分析

为了研究欧洲山杨中bHLH转录因子家族成员的分类和进化,分析其在干旱胁迫应激中可能行使的功能,本研究利用多种生物信息学手段从全基因组水平鉴定和解析欧洲山杨bHLH转录因子,并对干旱胁迫下的欧洲山杨根部转录组进行分析.结果显示,欧洲山杨的基因组中有167个bHLH转录因子家族蛋白.通过与拟南芥bHLH蛋白序列进行系统发育分析将其分为15个亚家族,并推测出39个PtbHLH的功能,这些功能表明bHLH转录因子家族涉及到欧洲山杨生长发育的多个生理过程.基因结构和motif分析显示,同一亚家族中几乎所有的PtbHLH都有相似的外显子/内含子排布和蛋白质motif结构.此外,利用RNA-seq数据分析干旱胁迫处理下PtbHLH基因的表达情况,筛选出4个潜在的bHLH抗旱蛋白.     

伤寒沙门菌非编码RNA AsrC表达特性及功能初步研究

非编码RNA在细菌的各种生命活动中都发挥着重要的功能.针对伤寒沙门菌非编码RNA AsrC,对其转录和降解特性及其所具有的功能进行初步研究.首先使用Northern blot和qRT-PCR的方法检测了σ因子rpoE和rpoS对AsrC转录的影响,分析了使用利福平抑制细菌RNA合成的情况下,RNase E和RNase III对AsrC降解的影响.其次使用AsrC缺陷株和高表达菌株分析细菌在酸、氧、高渗应激条件下的生长情况.再者通过全基因组芯片技术,研究AsrC高表达菌株基因表达的变化.进一步研究AsrC在细菌侵袭和巨噬细胞胞内生存力中的作用.结果显示,rpoE在酸应激下、rpoS在高渗应激下调节AsrC的转录.细菌中RNase E主要参与了AsrC的降解.高表达AsrC后,有40个基因表达上调,23个基因表达下调.AsrC高表达可以增强伤寒沙门菌对于上皮细胞的侵袭力,并且可以减弱细菌的胞内生存和增殖力.     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒nsLTP基因的差异表达

采用实时荧光定量PCR方法测定了辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)胁迫下辣椒抗病基因nsLTP的转录水平变化.结果 表明:与对照相比,疫霉胁迫下nsLTP基因表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低再升高的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6 h后表达量达到最大值,之后明显下降,相对表达量变化...     

杉木ClWRKY44基因克隆及其表达特性分析

【目的】以杉木幼叶为试验材料,通过克隆杉木ClWRKY44基因,分析其表达特性,为揭示杉木抗逆生理的分子机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR技术克隆杉木ClWRKY44 基因,对其进行生物信息学分析和亚细胞定位研究,并利用实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。【结果】杉木ClWRKY44 基因的开放阅读框(ORF)为1 776 bp,编码591个氨基酸,具有WRKY结构域。系统进化树分析结果显示ClWRKY44 基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)ATWRKY44 的亲缘关系较密切,其在杉木的不同器官(叶、根、茎) 中均有表达,嫩叶中的表达量最高,茎中次之,根中最低。低温胁迫处理6 h,ClWRKY44 基因相对表达量最高,约是对照组的79.8倍。干旱胁迫处理24 h,ClWRKY44 基因在高浓度干旱胁迫处理下的相对表达量最高,约是对照组的46.6倍。【结论】杉木ClWRKY44基因编码的蛋白质序列与拟南芥ATWRKY44的同源性很高,在调控植物逆境胁迫应答过程中可以发挥功能,为杉木幼苗生长发育的适应性提供参考。     

实时荧光定量PCR检测疫霉侵染下辣椒ERF基因的差异表达

本研究利用real-time荧光定量PCR技术检测辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici.)胁迫下辣椒抗病基因ERF的mRNA转录水平变化.结果表明:与对照相比,疫霉侵染下辣椒ERF基因的表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低的变化特点,该基因在早期被诱导表达,在胁迫6h后表达量达到最大值,之后逐渐下降...     

柳树NAC基因的克隆与表达模式分析

【目的】研究柳树重要抗逆转录因子基因家族,为揭示柳树抗逆分子机制提供理论依据。【方法】以‘苏柳2345’的转录组测序数据为基础,克隆了柳树NAC家族,并分析其序列结构、组织表达特异性以及不同胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆的两个柳树NAC转录因子基因分别命名为SlNAC1和SlNAC2。生物信息学分析表明:SlNAC1序列全长为1 126 bp,编码产物含343个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于细胞核;SlNAC2序列全长为1 139 bp,编码产物含291个氨基酸残基,为稳定的亲水蛋白,定位于叶绿体。两个基因均具有典型的NAM结构域及A、B、C、D、E 5个亚结构域,还包括共同的LPPG、YPNG 和DEE保守基序及NAC抑制结构域。系统进化树分析显示, SlNAC1基因与木薯亲缘关系最近,SlNAC2基因与茄子亲缘关系最近。定量PCR结果显示SlNAC1和SlNAC2均在叶片表达,根中没有表达,为叶片特异性转录因子。定量PCR结果显示SlNAC1基因在脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)处理24 h后显著上调,SlNAC2基因在聚乙二醇(PEG)、ABA和GA胁迫后显著上调。【结论】柳树SlNAC1基因在非生物胁迫下表达较为稳定,受ABA和GA胁迫诱导;SlNAC2受干旱、ABA和GA胁迫诱导,受影响明显高于SlNAC1,不受乙烯剂(ETH)胁迫影响。推测SlNAC1和SlNAC2参与GA、ABA信号传导,可能不参与ETH的信号途径。