拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子，通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码，包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3，在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列，设计了一对PCR引物，用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。     

小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明，该序列具有完整的读码框，推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1，2，3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础，构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法转化烟草，PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

高盐诱导特异启动子ThAVA-P3-Pro的克隆及序列分析

研究发现,一种在高盐适应中起关键作用的蛋白—液泡膜质子泵c亚基AVA-P3的表达在盐芥根部被高盐所诱导,而在拟南芥中变化不大。为进一步研究盐生植物盐芥的耐盐机制。以山东生态型盐芥(Thellungiella halophila)基因组DNA为模板,通过设计特异引物,PCR扩增得到盐芥高盐诱导特异启动子Th AVA-P3的9个不同长度的系列缺失片段,将这些片断分别克隆到PGEM-T载体上。序列分析表明,Th AVA-P3启动子的9个不同长度的系列缺失片段的大小分别为2 087 bp、1 711 bp、1 411 bp、987 bp、851 bp、769 bp、679 bp、436 bp、191 bp。与已报道的序列完全相同。生物信息学分析表明,Th AVA-P3-pro中存在包括响应与外界环境刺激、激素和其他生物胁迫等有关的22种顺式作用元件;推测这种关键耐盐基因Th AVA-P3的表达模式可能在盐芥的耐盐机制中发挥了重要作用。该研究可为进一步探讨Th AVA-P3-pro在逆境应答中的作用提供实验依据。     

盐芥ThPHT1;8基因的克隆和功能分析

磷(P)是植物生长发育过程中重要的矿质营养元素之一,PHT1磷酸转运蛋白家族负责调控植物从土壤中吸收磷以及细胞间无机磷(Pi)的转运.本文以盐芥幼苗根cDNA为材料,克隆到盐芥磷酸转运蛋白ThPHT1;8基因.生物信息学分析结果表明,ThPHT1;8蛋白编码525个氨基酸残基,蛋白分子质量为58.1,ku,等电点6.33,是一个定位在细胞膜上的疏水、无信号肽的非分泌性蛋白,含有高亲和力磷酸转运蛋白典型的跨膜结构.实时定量PCR结果显示,低磷胁迫能促进ThPHT1;8基因在盐芥根部的表达,而且不同磷浓度处理下ThPHT1;8基因表达的模式不同.ThPHT1;8基因在转基因拟南芥中的生物学功能研究表明,不同浓度低磷胁迫处理下,与野生型拟南芥相比,35S:ThPHT1;8转基因拟南芥幼苗的主根根长显著增加、侧根密度显著降低,叶绿素含量、无机磷和总磷含量提高,花青素含量降低.上述结果表明,盐芥ThPHT1;8基因确实参与低磷胁迫时植物的应答,能够提高转基因拟南芥的耐低磷能力,为土壤磷高效利用提供了一种有潜力的候选功能基因.     

短时盐胁迫对盐芥和拟南芥抗氧化物酶的影响

本文测定了24h盐胁迫下盐芥(6周)和拟南芥(3周)中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,分析了盐胁迫下3种抗氧化物酶在两种植物中的响应特征.结果表明,拟南芥叶片中3种酶活性的变化特征为随盐处理浓度增加,SOD呈逐渐上升趋势,CAT呈逐渐下降趋势,POD活性上升幅度较大,且在200mM NaCl处理条件下,SOD和POD活性达到最大;盐芥根中的SOD、POD、CAT本底活性皆高于叶片.随着盐处理浓度增加,SOD活性基本无变化,叶片中的POD活性逐渐降低,CAT活性逐渐增加.而根中的POD活性却出现递增、CAT为先增加后降低现象.盐芥中的SOD本底含量水平高于拟南芥.     

拟南芥转录因子CBF1基因杂交狼尾草的转化

CBF1转录激活因子是一类存在于拟南芥中受低温诱导的反式作用因子,能有效提高植物抗低温、抗干旱的能力.因此以拟南芥叶片为材料,通过PCR方法成功地克隆CBF1转录因子基因,并将其连接到植物表达载体pBI121上,通过农杆菌介导法转化杂交狼尾草叶片,成功获得转基因再生植株.     

盐胁迫下盐芥和拟南芥内源激素质量分数变化的研究

采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定了盐胁迫下盐芥(Thellungiella halophila)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片中生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(ZR)和脱落酸(ABA)等4种内源激素的质量分数,分析了2种植物的4种内源激素在盐胁迫下的响应特征.结果表明:48 h盐胁迫下拟南芥中的ABA质量分数增加2～2.7倍,是主要的胁迫响应激素;盐芥中呈积累增加的是IAA、ZR、GA,皆为促进生长的激素.说明盐胁迫下2种植物的激素应答方式不同.     

盐芥WBC11克隆与RNAi载体的构建

作为植物在非生物胁迫下耐受机制研究中的模式植物之一,盐芥具有耐受干旱、高盐和高低温等抗逆性特点.本文以盐芥中脂类代谢的关键基因WBC11作为研究对象,利用q-PCR技术克隆盐芥WBC11 5’端300bp序列(简称WBC11-300),通过gateway的方法构建RNAi表达载体并成功转入农杆菌中,为探索盐芥WBC11功能的后续实验打下了基础.     

新疆无苞芥OpNAC083基因的克隆与表达分析

本研究通过对新疆耐逆植物无苞芥幼苗c DNA文库的随机克隆测序分析,获得1条与拟南芥NAC转录因子基因At NAC083高度相似的EST序列(Gen Bank登录号为JZ151841),该序列包含1个723 bp最大开放阅读框(ORF),推测编码240个氨基酸。根据该ORF序列设计引物,利用RT-PCR技术从无苞芥叶片的c DNA中克隆了该基因,命名为Op NAC083。比对分析结果表明在其N端具有一段No apical meristem(NAM)保守结构域;该蛋白的二级结构包含33个α-螺旋和11个β-转角。系统进化树分析结果表明,Op NAC083编码产物与拟南芥At NAC083和琴叶拟南芥ANAC083进化关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析基因表达结果显示,Op NAC083在无苞芥的不同组织中都有表达,在叶中表达量最高;高盐胁迫处理2 h、ABA处理6 h明显诱导该基因的表达,但PEG-6000和4℃胁迫却抑制该基因的表达。这表明Op NAC083在无苞芥应对盐和ABA胁迫中可能起着重要作用。     

木榄细胞膜Na~+/H~+逆向运输蛋白BgSOS1功能的初步验证

根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因,该片段包含1个3 462 bp的开放阅读框,可编码1 153个氨基酸的多肽.生物信息学的分析结果表明:该氨基酸序列所编码的蛋白与拟南芥、番茄、水稻、小麦、盐芥和杨树的SOS1蛋白高度同源,同源性分别为63.86%,66.61%,62.18%,60.19%,63.97%和75.97%;BgSOS1蛋白的N端含有12个跨膜的结构域,C端为1个较长的胞内结构域.尽管单个BgSOS1的表达并不能提高转基因酵母的抗盐性,但SOS1,SOS2和SOS3共表达的酵母,其抗盐性明显提高,这表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可能通过调控BgSOS1的Na+/H+交换功能来提高木榄的抗盐机理.     

一种带有表型标记基因的诱导型抗旱植物表达载体的构建

为了克服组成型表达转录因子基因影响转基因植物性状的缺点,并构建一种具有级联放大作用并带有表型标记的诱导型植物双价表达载体。研究采用PCR方法从拟南芥克隆获得冷诱导转录因子CBF3基因,蜡质合成相关WIN1基因,干旱诱导RD29A基因启动子和冷诱导的LEA14基因启动子,并用CBF3转录因子所调控的下游RD29A基因启动子和LEA14基因启动子分别驱动CBF3基因和W1N1基因表达,构建了双价植物表达载体RD29AP-CBF3／LEA14P—WIN1／pcAMBIA2201。我们预测在转基因植物中,该表达系统可在干旱等逆境信号存在条件下,通过级联放大的方式诱导表达,在增加植物抗逆性的同时,增加叶片表层蜡质的积累,从而易于表型识别。本研究为利用花粉管通道法转化棉花,提高抗逆转基因棉花田间筛选的效率奠定了基础。     

AhBG1转基因拟南芥的ABA敏感性和抗旱性研究

为探究花生基因AhBG1对拟南芥ABA敏感性和抗旱性的影响,以过表达AhBG1拟南芥为材料,检测其ABA敏感性及脱水处理下ABA质量分数、叶片失水率、干旱存活率及ABA稳态相关基因表达变化. 结果表明:AhBG1是编码花生β-葡萄糖苷酶的家族成员,定位于细胞质;与野生型相比,AhBG1过表达拟南芥植株在干旱条件下体内ABA水平提高,干旱存活率增加,增强有关生物合成途径和信号转导途径相关基因上调,抑制氧化代谢途径相关基因表达. AhBG1蛋白可能催化ABA-GE形成ABA,提高植物体内ABA的质量分数,通过影响ABA稳态相关基因的表达从而提高植物的抗旱性.     

白桦BpGRAS1基因的克隆及耐盐功能分析

【目的】 GRAS转录因子是植物特有的转录因子家族之一,在植物响应盐、干旱等非生物胁迫中发挥重要的调控作用。从白桦(Betula platyphylla )中克隆GRAS转录因子基因,研究其耐盐功能,为研究木本植物GRAS转录因子的抗逆机制奠定理论基础。【方法】 在白桦转录组数据库中获得一个GRAS转录因子基因,命名为BpGRAS1 (GenBank 登录号: MN117546.1)。利用生物信息学进行多序列比对、构建进化树。分别构建植物过表达(pROKⅡ-BpGRAS1) 及抑制表达(pFGC5941-BpGRAS1) 载体。利用农杆菌介导高效瞬时遗传转化体系获得BpGRAS1基因瞬时过表达(OE)、抑制表达(IE) 及对照 (WT) 白桦植株。通过实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) 技术分析盐胁迫下OE、IE及WT植株中BpGRAS1基因的表达情况,鉴定转基因植株中BpGRAS1的表达效率是否响应盐胁迫。在盐胁迫下比较了BpGRAS1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株的电解质渗透率、失水率、丙二醛(MDA) 含量、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性。【结果】 BpGRAS1基因的开放阅读框为1 425 bp,编码 474个氨基酸。BpGRAS1具有GRAS家族的序列特征,在C端的氨基酸序列相似度较高,与AtSHR亲缘关系较近。盐胁迫处理下,BpGRAS1的表达量升高,过表达植株中表达量高于对照,抑制表达植株中表达量低于对照,说明BpGRAS1受盐胁迫诱导,成功获得过表达及抑制表达植株。过表达BpGRAS1基因能降低白桦在盐胁迫下的电解质渗透率、失水率及 MDA 的积累,并显著增强了 POD 和 SOD 酶的活性,从而提高转基因植株的耐盐性。【结论】 BpGRAS1基因响应盐胁迫,过表达BpGRAS1基因降低了盐胁迫下植株细胞受损程度,通过增强POD 和 SOD 活性提高白桦的耐盐能力。     

毛白杨果胶甲酯酶PtoPME34-1调控植物抗旱性研究

为了探究林木植物中果胶甲酯酶PME的功能,本研究中,我们从毛白杨中克隆出拟南芥PME34的同源基因PtoPME34-1,阐述了该基因在毛白杨中的生物学功能.生物信息学分析表明,毛白杨PtoPME34-1基因与毛果杨PtrPME34-1序列相似性为100%,与拟南芥AtPME34序列相似性为93%.组织特异性表达分析显示PtoPME34-1基因在所有组织都有表达,在基部茎、木质部的表达量较高,在老叶表达量最低.蛋白亚细胞定位结果显示,绿色荧光蛋白GFP标记的PtoPME34-1-GFP融合蛋白定位在烟草叶片细胞壁.毛白杨PtoPME34-1基因过表达显著提高植株的抗旱性.毛白杨PtoPME34-1和PtoPME34-2基因的双突变体植株中果胶甲酯化程度升高,且植物抗旱性也显著增加.这些研究结果证实PtoPME34-1在调控植物生长发育和抗旱胁迫中发挥重要作用.     

AtOSAK1在植物氧化胁迫响应中的功能研究

植物类蛋白激酶ABC1家族(Activity of bc1 complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中扮演着重要的作用.该课题组克隆并研究了ABC1家族中一个的基因At OSAK1.半定量RT-PCR检测及启动子驱动GUS报告基因分析的结果显示,At OSAK1基因的表达无组织特异性,且受甲基紫精(MV)的诱导表达.At OSAK1-GFP亚细胞定位显示,At OSAK1蛋白定位在叶绿体中.不同浓度MV处理条件下,过表达At OSAK1植株的种子萌发率和存活率比野生型(Col-0)和突变体osak1高.这些研究表明,At OSAK1基因参与了抗氧化胁迫的响应.     

Molecular characterization of GmNHX2, a Na＋/H＋ antiporter gene homolog from soybean,and its heterolosous expression to improve salt tolerance in Arabidopsis

Na＋/H＋ antiporters have been well documented to enhance plant salt tolerance by regulating cellular ion homeostasis. Here, a putative Na＋/H＋ antiporter gene homolog GmNHX2 from soybean was cloned and predicted to encode a protein of 534 amino acids with 10 putative transmembrane domains. GmNHX2 was expressed in all soybean plant tissues but enriched in roots and its expression was induced by NaCI and polyethylene glycol （PEG） treatments. GmNHX2 exhibits greater sequence similarity with LeNHX2 and AtNHX6 than that of AtNHX1 and AtSOS1. Although phylogenetic analysis clustered GmNHX2 with organellar （tonoplast and vesicles） antiporters, the GmNHX2-EGFP （enhanced green fluorescent protein） fusion protein was possibly localized in the plasma membrane or organelle membrane of transgenic plant cells, Furthermore, transgenic Arabidopsis plants expressing GmNHX2 were more tolerant to high NaCl concentrations during germination and seedling stages when compared with wild-type plants. These results suggest that GmNHX2 is a membrane Na＋/H＋ antiporter and may function to regulate ion homeostasis under salt stress.