p53基因在小鼠胚胎发育过程中的表达

以E9日龄至E14日龄昆明种正常小鼠胚胎为材料,利用质粒扩增的、地高辛标记的基因探针在组织切片上进行DNA-mRNA 分子原位杂交,研究了p53基因在小鼠胚胎发育过程中的表达.结果表明, p53基因不参与E9和E10日胚胎发育中的器官原基形成,参与器官的进一步分化成熟过程.这些器官主要有眼、脑、心、肺、脊柱和面颌骨,肝组织的发育与其无关; p53基因一方面参与胚胎发育中的细胞周期调控,另一方面也参与了某些与细胞周期无关的过程;不同的器官有不同的细胞周期调控机制.     

P16基因在小鼠胚胎发育过程中的表达

以E9 d龄至E14 d龄昆明种正常小鼠胚胎为材料，利用质粒扩增的、地高辛标记的基因探针在组织切片上进行DNA-mRNA分子原位杂交，研究了p16基因在小鼠胚胎发育过程中的表达.结果表明：p16基因不参与E9和E10 d胚胎发育中的器官原基形成，参与器官的进一步分化成熟过程，这些器官主要有眼、脑、心、肺、脊柱和面颌骨，肝组织的发育与其无关；不同的器官有不同的细胞周期调控机制.     

棕色田鼠睾丸和附睾胚后发育中的雌二醇表达

应用免疫组织化学方法研究了产后1日龄、10日龄、25日龄、45日龄及60日龄(成体)5个发育阶段的棕色田鼠(Microtus mandarinus)睾丸和附睾中雌二醇(estradiol,E2)的表达.结果表明:1日龄,睾丸生殖母细胞有E2阳性表达.10日龄,生殖母细胞E2表达减弱(P<0.05).25日龄,E2表达主要见于精子细胞.45日龄,精母细胞和精子细胞中有E2表达.60日龄,精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子中均有E2表达,精母细胞和精子细胞表达较强,精原细胞表达较弱.在胚后发育过程中,1日龄和10日龄间质区细胞的E2表达最强,25日龄和45日龄E2表达减弱,60日龄E2表达最弱(P<0.05).1日龄至60日龄附睾上皮细胞和连接组织均有E2表达,60日龄附睾管内有大量精子,且有明显的E2表达.这些结果说明,棕色田鼠从出生到性成熟过程中,生殖细胞和间质细胞有E2生成.在精子发生的各阶段,雌激素通过其受体可能对生精细胞的分化和增殖有直接调控作用,对间质细胞的发育也存在着调节作用.同时,附睾的发育和精子的成熟也受到雌激素的调节.     

MT—hGH基因注入小鼠受精卵的研究

用显微注射法，将MT－hGH融合基因注入昆明白小鼠受精卵雄原核中，受注的原核卵经体外培养发育的198枚2细胞胚、45枚桑椹胚和161枚胚泡，移植到54只假孕受体，其中16只妊娠产仔只，存活到供试的仔鼠25只，小鼠长到3个月后，切尾制备DNA，经DNA斑点杂交和Southern印迹杂交检测基因整合情况，25只小鼠中3只有融合基因整合，称为转基因小鼠，仔鼠21日龄离乳后饮水中加入锌（Za^ )，以诱导融合基因表达，85日龄时，转基因小鼠体重比对照组重32．0％，还讨论了基因整合方式对胚胎发育的影响。     

小鼠着床前胚胎Dicer 1和DGCR 8基因的表达

研究了miRNA生成相关基因Dicer 1和 DGCR 8在小鼠着床前胚胎各发育阶段的表达,探讨其对着床前胚胎发育的作用.建立小鼠超排、交配系统,采集着床前胚胎;采用二步法RT-PcR方法鉴定着床前胚胎Dicer1和DGcR 8表达.结果显示:小鼠卵母细胞及受精后1.5 d、2.5 d、3.5 d和4.5 d着床前胚胎均表达Dicef 1和DGcR 8基因.这是着床前胚胎IlliRNA生成物的重要基因,miRNA及其生物合成相关基因可能对着床前胚胎发育起重要作用.     

表达HIV-1复合多表位基因的p815细胞稳定株的建立和评价

建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+).在阳离子聚合物作用下重组真核质粒转染的p815(H-2d)细胞, 以G418压力筛选,RT-PCR检测mRNA表达,间接免疫荧光检测蛋白表达.通过PCR获得了HIV-1 p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG融合基因,成功构建了p24MEG基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/p24MEG.转染p815细胞后, RT-PCR检测到融合蛋白mRNA表达,间接免疫荧光显示 p815细胞内有融合蛋白的表达.结论:建立了稳定表达HIV-1p24MEG融合蛋白的p815细胞克隆,为评价多表位抗原p24MEG在BALB/c小鼠体内诱导的细胞免疫应答奠定基础.     

小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其编码蛋白的细胞内定位

研究了小鼠T细胞发育相关基因RS21-C6的表达谱及其在细胞内的定位.提取小鼠8种组织及处于5个发育阶段的胸腺细胞总RNA,逆转录成cDNA后,利用RS21-C6基因特异性引物,观察了RS21-C6基因的表达;同时构建pEGFP-N3/RS21-C6重组表达载体,在激光共聚焦荧光显微镜下观察了细胞内荧光分布.RT-PCR结果表明RS21-C6基因在所检测的组织和细胞中除骨骼肌和CD4SP胸腺亚群外均有不同程度的表达.激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,RS21-C6-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白表达在胞浆内,RS21-C6-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果.     

猪表皮生长因子在大肠杆菌中的串联表达

根据Gen Bank中猪表皮生长因子(p EGF)基因信息设计引物,通过PCR、亚克隆、基因重组等技术,构建得到p EGF拷贝数分别为1、2、3的原核重组表达质粒.用重组质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,在37℃诱导条件下,1、2、3拷贝p EGF重组质粒均能表达p EGF蛋白,灰度值分析表明:表达的融合蛋白占菌体蛋白总量分别为9.54%、20.37%、26.79%,表明在原核表达中,对p EGF进行同向串联,增加其拷贝数,可以提高p EGF在表达后融合蛋白中所占比例,相应提高p EGF蛋白产量.本研究为p EGF重组蛋白的高效表达和批量生产提供可靠的依据.     

小鼠囊胚发育阶段miRNA表达的研究

研究小鼠囊胚发育阶段miRNA的表达,探讨miRNA在着床前胚胎发育中的作用.采用miRNA芯片技术和RT-PCR方法,鉴定小鼠囊胚发育阶段miRNA的表达.在小鼠囊胚发育阶段共筛查到124个miRNA,其中包括与发育和细胞分化相关的miRNA let-7e、miR-125a和miR-181a.说明小鼠囊胚发育阶段表达大量的miRNA,有可能对着床前胚胎发育和分化过程起重要的调控作用.     

dDnmt2与dMBD2/3在果蝇不同发育时期的转录表达

为了深入了解果蝇DNA甲基化修饰系统及其相关基因的表达特点及功能,以黑腹果蝇Canton S品系为材料,应用实时荧光定量PCR方法检测分析不同发育时期果蝇dDnmt2与dMBD2/3基因的转录表达.结果表明:dDnmt2与dMBD2/3分别在6～9 h和0-3 h胚胎期表达量最高,在12～15 h和18～21 h胚胎、三龄幼虫、蛹、成虫期表达明显降低.果蝇dDnmt2和dMBD2/3基因的表达特点与果蝇不同发育时期基因组DNA甲基化水平相一致.     

5种细胞周期调控基因在小鼠生殖细胞发育过程中的表达研究

 以成熟(10周龄以上)的昆明种正常小鼠的精巢和卵巢为材料,利用地高辛标记的基因探针进行组织切片上的DNA-mRNA分子原位杂交,研究了PCNA,cdc2,cyclin D1,p2 1和 p16 5种细胞周期调控基因在生殖细胞发育过程中的表达.结果表明:PCNA基因在睾丸组织的精原细胞和精母细胞中有强杂交信号,而在雌性生殖细胞及滤泡细胞的发育过程都没有杂交信号;cyclin D1,cdc2,p2 1,p16基因在生殖细胞的发育过程中都没有,表明这些基因并没有参与小鼠生殖细胞的生长和分化调控.这些事实表明在生殖细胞发育过程中,控制细胞增殖和增殖抑制的基因与培养细胞有不同的机制,它们可能采用了不同的调控系统.     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

Domain of Ultrabithorax expression in Drosophila visceral mesoderm from autoregulation and exclusion

Domains of differential homeotic gene activity are formed at specific positions along the anteroposterior axis of the early Drosophila embryo. Homeotic genes are required continuously throughout development, so that homeotic gene activity has to be maintained independently of the positional information provided in the early embryo. In the ectoderm, the domains of homeotic gene activity partially overlap, but we have found that in the visceral mesoderm at least three of these genes are expressed in adjacent and mutually exclusive domains. It has been proposed that stable, sharply demarcated domains of this type could be established if a homeotic gene product stimulated its own expression locally and inhibited the expression of other homeotic genes, which Meinhardt has termed autocatalysis and mutual exclusion respectively. Furthermore, autocatalysis of this kind can in principle account for the maintenance of homeotic gene activity throughout development. We find that the unique domain of Ultrabithorax (Ubx) expression in the visceral mesoderm is dependent both on autocatalysis and on an exclusion mechanism: Ubx product is required for its own synthesis, whereas the product of the posteriorly adjacent gene abdominal-A represses Ubx expression.     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

Cyclin D1与p21WAF1在鼻咽癌中的表达

目的探讨鼻咽上皮癌变过程中周期蛋白CyclinD1与抑癌基因p21（wild—type p53 activated fragment 1,p21wAF1）蛋白的表达及其意义。方法应用免疫组化方法检测47例鼻咽癌组织、21例癌旁上皮组织和14例正常鼻咽粘膜中Cyclin D1与p21WAF1蛋白表达。结果从鼻咽正常粘膜、癌旁粘膜上皮组织到癌组织,Cyclin D1表达阳性率逐渐增加,并且差异有显著意义（均为P〈0．05）。p21WAF1蛋白在以上组织中阳性率较高,且各组间差异无显著性。结论Cyclin D1、p21WAF1蛋白与鼻咽部上皮细胞恶性增生密切相关,p21wA兀蛋白表达可能与细胞周期调控的反馈机制有关。     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。     

乙型肝炎病毒HBX基因的克隆、表达和蛋白的纯化

克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。