GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d的原核表达、鉴定及纯化

研究羊布鲁菌外膜蛋白Omp25d基因的克隆,原核表达,以及纯化,根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白Omp25d蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为650bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-Omp25d。在大肠杆菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定GST-Omp25d蛋白。结果成功地构建了pGEX-4T-1-Omp25d原核表达载体并在大肠杆菌中表达了Omp25d基因,纯化后所获得的融合蛋白与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pGEX-4T-1-Omp25d元和表达载体,并且在大肠杆菌中进行表达,纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2 金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200 mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅲ区基因的克隆表达及亲合层析纯化

克隆表达JEVE蛋白Ⅲ区基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从JEVcDNA中扩增Ⅲ区基因,用限制性内切酶消化后插入到PMD-18T载体,序列测定正确后,再亚克隆到融合表达载体pET32a中。转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白。在变性条件下对目的蛋白进行纯化,获得了融合6个组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白,蛋白纯度大于80%。证实构建了JEVEⅢ基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2626c基因的表达、纯化和鉴定

克隆结核分枝杆菌Rv2626c基因,构建其原核表达载体,并进行表达、纯化及鉴定.采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv2626c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,转化入E.Coli DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后与抗His单抗进行Western-blot,以Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.PCR扩增获得的目的基因为432bp,与预期大小一致,测序与Genebank公布的基因序列完全一致.成功构建原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,转化E.Coli DH5α后能特异性表达目的蛋白,大小约16KD,与理论值相一致.蛋白可溶性分析表明该蛋白主要以可溶性方式存在,纯化蛋白经Western-blot鉴定有特异性反应条带.成功构建结核分枝杆菌Rv2626c原核表达载体pPro-EXHTb-2626c,并获得纯化的目的蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础.     

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。     

乙型肝炎病毒x基因蛋白转导载体的构建

乙型肝炎病毒X蛋白在细胞转化和肝癌的发生发展中具有重要作用.为了深入研究X蛋白的致癌机理构建了pTAT-GFP-X载体.该研究以克隆在真核表达载体pCMV-X质粒中的x基因为模板,设计了x基因的PCR引物,采用PCR方法扩增x基因,回收PCR产物,以XhoI和EcoRI酶切位点将PCR产物连接到蛋白转导系统pTAT-GFP载体中,再用XhoI和EcoRI酶对筛选的重组子进行酶切鉴定,获得了510bp的目的片段,表明已成功地将目的片段克隆在pTAT-GFP载体中.经DNA序列分析检测,显示克隆的x基因无突变.经SDS-PAGE和Westernblot检测证实,将重组质料pTAT-GFP-X转化致大肠杆菌BL21中,可表达pTAT-GFP-X融合蛋白.该pTAT-GFP-X载体蛋白转导系统的构建,为进行X蛋白的蛋白转导实验奠定了基础.pTAT-GFP-X融合蛋白具有穿透细胞膜进入细胞的能力,进而在细胞内发挥作用,与转基因不同,无需细胞内基因表达的过程,使得X蛋白的定量实验成为可能,X蛋白的蛋白转导实验更有助于探讨x基因的致癌机理.     

HIV-1外膜蛋白原核表达载体的构建与表达

为原核表达免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)外膜蛋白,对HIV-1外膜蛋白的基因进行了修饰,并利用PCR技术克隆env基因,将env基因克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达外膜蛋白,应用Western blotting检测其表达情况.结果表明:酶切鉴定证实正确地构建了pRSETB表达质粒,Western blotting和SDS-PAGE试验检测结果表明,构建后的env基因能在低温诱导的条件下表达.产物的相对分子质量为50000和33000,表达的env蛋白具有较好的免疫原性.     

Polyclonal antibody against an insect excitatory toxin BmKIT from Buthus Martensii karsch and detection of BmKIT expressed in transgenic cotton

An insect excitatory toxin gene from Buthus martensii Karseh （BmKIT） was cloned into the expression vector, pET-28a. BmKIT was expressed as inclusion bodies in Eseherichia coli BL21 （DE3） host cells. The authenticity of in vitro expressed protein was confirmed by Western blot. The inclusion body protein band in SDS-PAGE was excised and the protein, BmKIT, was extracted. Polyelonal antibodies to the purified protein were raised in rabbits. The antibody reacted specifically with the expressed BmKIT and was used to quantify its presence in transgenic cotton.     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.     

Cloning, sequencing and expression of the coat protein gene of Cocksfoot mottle virus

The coat protein (CP) gene of Cocksfoot mottle virus (CfMV) was amplified by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-4T-1, and the resulting plasmid was designated as pGEXCfMV-JANCP. The fusion protein GST-CP was expressed in BL21 (DE3) pLysS after IPTG induction. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the CfMV-CP gene was efficiently expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS through IPTG induction and the 56.0 kD protein was obtained.     

Cloning, sequencing and expression of the coat protein gene of Cocksfoot mottle virus

The coat protein (CP) gene of Cocksfoot mottle virus (CfMV) was amplified by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-4T-1, and the resulting plasmid was designated as pGEXCfMV-JANCP. The fusion protein GST-CP was expressed in BL21 (DE3) pLysS after IPTG induction. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the CfMV-CP gene was efficiently expressed in E.coli BL21 (DE3) pLysS through IPTG induction and the 56.0 kD protein was obtained.     

大鼠肌肉素cDNA克隆及表达

通过RT-PCR方法从大鼠骨骼肌中克隆到肌肉素cDNA,构建表达载体pGEX-5X-3-musclin,并在BL21大肠杆菌中成功表达了融合蛋白GST-Musclin,且对表达条件进行了优化.在最优化的表达条件下,融合蛋白的表达量达到了14.2%.