一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体，PCR合成ompT引导序列，插入该载体多克隆位点上游，构建了分泌型原核表达载体pTO-OT．将2个外源基因克隆至pTO-OT，2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达．表达产量在25％～34％之间．Western blot分析证实了融合蛋白可被大肠杆菌信号肽酶有效地切割。并具有良好的免疫学活性．对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的表达稳定性，显示了其在基因工程中的应用价值．     

酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

缺氧缺血性脑损伤新生猪血清IGF-1和IGFBP-3的改变以及脑皮质细胞凋亡的研究

研究缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生猪血清IGF－1和IGFBP－3的变化趋势和脑皮质细胞凋亡的程度，探讨缺氧缺血性脑损伤的发病机理，将3日龄新生猪随机分为对照组和HIBD组，在HIBD后1，24，48和72h采集静脉血，采用免疫放射法测定IGF－1和IGFBP－3血清水平，应用流式细胞术对新生猪HIBD脑皮质细胞凋亡进行定量分析，HIBD后72h血清IGF－1和IGFBP－3水平明显低于对照组，HIBD后72h血清IGF－1值显著低于HIBD后1，24和48h组，HIBD后72h血清IGFBP－3水平明显低于HIBD后48h组，而脑皮质细胞凋亡百分率在HIBD后72h血清IGFBP－3水平明显低于HIBD后48h组，而被皮质细胞凋亡百分经在HIBD后72h明显高于对照组、HIBD后1，24和48h组，应用Logistic回归分析可知HIBD脑损伤后IGF－1和IGFBP－3与脑细胞凋亡百分率具有非线性相关关系，HIBD后72hIGF-1少IGFBP－3明显下降，这可能与组织对IGF－1的需求增加，IGF－1的重新分布，生长激素轴的中枢性抑制以及神经元的凋亡有关。     

烟草坏死病毒植物病毒载体的构建

烟草坏死病毒A是单链RNA病毒，它的全基因组序列已被测出，含有6个开放表达阅读框。利用套叠PCR的方法将克隆于pMD18-T载体上烟草坏死病毒A基因的ORFⅣ与ORFⅤ（外壳蛋白）之间的非编码区形成突变SphI位点，最后将突变后的TNV-A全基因插入植物表达载体pE1802的SadI／SmaI之间，构建成植物病毒载体pE1802-TNV。     

哺乳藏猪肠道CAT1、EAAC1和Pept1 mRNA的发育性表达分析

选取体重接近且健康的哺乳藏猪30头,其中1、7、14、21和28日龄各6头,运用实时定量PCR对Pept1、EAAC1、CAT1 mRNA表达的发育性变化进行研究。结果表明,在十二指肠中藏猪CAT1、Pept1 mRNA表达的发育性变化相似,14日龄时表达丰度最高;EAAC1、CAT1 mRNA在空肠中表达的发育性变化相似,CAT1在21日龄达到最高点,但与其他日龄相比差异不显著;回肠中Pept1与EAAC1 mRNA表达丰度具有相似的发育性变化,7日龄回肠Pept1 mRNA表达量最高,显著高于其他各发育阶段(P0.05)。     

人神经营养因子-3在哺乳动物细胞中瞬时表达和稳定表达的初步研究

将人神经营养因子－3全长cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3,分别COS-7儿CHO细胞中获得了瞬时表达和稳定表达，经大乳鼠脊髓背根神经节测活，瞬时表达和稳定表达产物均能明显促进其神经突起的生长，瞬时表达量约为10^-7g/mL，稳定表达量可达10^-8g/mL。     

水稻中一个与花发育相关的MADS-box基因的表达检测

根据MADS－box基因的保守区结构，设计简并性引物，利用RT－PCR从水稻（Oryza sativa L.)中克隆到一个新的水稻MADS－box基因cDNA睛段，将它命名为FDRMADS5．该基因核苷酸序列851bp,编码160个氨基酸，有典型的植物MADS－box基因的结构，FDRMADS5的Southern分析，表明它为单拷贝基因，用Northern检测了FDRMADS5的表达情况，发现该基因除了在花中有表达外，在水稻的根尖和幼苗端中也有微量的表达，这一结果表明，水稻的MADS－box基因功能可能并不局限于控制花的发育。     

在胎儿发育过程中人MK基因的组织差异性表达

MK是肝素结合因子家族中的一个成员，用RT－PCR研究了第11－16周胎儿龄的胎儿的神经组织与非神经组织中MK基因的组织差异性表达，随着胎儿龄的增加，在神经组织中，MK呈现出规律性的从无互有和从低表达到高表达的趋势，提示它可能在胎儿脑的发育中起着重要的作用，在其他非神经组织中，尽管各组织中MK的表达呈现不同的规律，但看起来总的趋势是趋向活跃。     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性

以结核分枝杆菌H₃₇Rv基因为模板, PCR反应扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因（ICL）, 将其克隆入原核表达载体pET28b中, 并将pET28b I
CL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达. 结果表明, ICL蛋白的最佳诱导表达条件为: 温度20 ℃, IPTG终浓度为025 mmol/L, 诱导表达4 h, 在此条件下 ICL实现了高效表达, 以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化ICL蛋白, 纯化程度较高. 酶学性质鉴定表明, 实验获得了具有生物学活性的重组蛋白, 重组ICL的比活力为24 μmol/(mg·min).     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

高产S-腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建

应用PCR技术,以大肠杆菌BL21（DE3）染色体DNA为模板,扩增得到S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶基因。将所得基因连接至表达载体pET-22b（+）,利用T7强启动子进行转录,然后转化进E. coli BL21（DE3）表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶基因的基因工程菌。重组菌所表达的酶活为115U/g（以细胞干重计）。     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

毒性小分子蜂毒肽基因的克隆修饰、融合载体构建及表达研究

通过定点诱变的方法，对小分子蜂毒肽（melitin）基因进行修饰，引入了羟胺裂解位点，使蜂毒肽与其前体蛋白得以在体外融合表达．将融合的蜂毒肽前体蛋白（prcmelittin）经双酶切后克隆到原核表达载体PET-42a（＋）中，PCR鉴定后转化至宿主菌BL21（DE3）中，在异丙祭硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下，在大肠杆菌中实现融合表达．为利用基因下程的方法表达毒性小分子多肽、实现该类药物的产业化打下基础．     

人神经营养素-4基因的原核表达与纯化

以人外周血淋巴细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出神经营养素-4基因(NT-4)成熟蛋白的DNA序列,并将其克隆到表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后高效特异表达了分子量约为35kD的蛋白,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经Ni^2 -NTA树脂亲和层析纯化,得到了纯度达94％的NT-4成熟蛋白的融合蛋白．为进一步研究NT-4的生物学活性及在临床治疗中的作用打下了基础．     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.