一种cDNA-5′末端的克隆方法

应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TDT)在cDNA 5′末端加同聚物尾的方法 ,通过延长加尾时间、改变加尾步骤 ,大大加强了加尾效率 ,使得在cDNA末端快速扩增技术 (RACE)中应用TDT加尾法进一步获得mRNA的 5′端成为一种行之有效的方法 .     

一种cDNA—5′末端的克隆方法

应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TDT）在cDNA 5′末端加同聚物尾的方法，通过延长加尾时间，改变加尾步骤，大大加强了加尾效率，使得在cDNA末端快速扩增技术（RACE）中应用TDT加尾法进一步获得mRNA的5′端成为一种行之有效的方法。     

青岛文昌鱼神经胚中期cDNA文库的构建

提取青岛文昌鱼18小时神经胚中期mRNA,以5＇脱磷的NotI-oligo(dT)18为引物,反转录合成cDNA.双链cDNA的5＇端钝端连接上带EcoRI突出末端的衔接头,再经NotI酶切,在cDNA的3＇端形成NotI突出末端.以SizeSep离心层析柱除去400bp以下的小分子,与带有NotI和EcoRI突出末端并经过5＇端脱磷的λExCellNotI/EcoRI/CIP载体DNA进行连接,经体外包装和感染NM522宿主菌,得到了3.6×10     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

甘薯类胡萝卜素合成酶基因pds全长cDNA的克隆

根据双子叶植物类胡萝卜素合成结构基因氨基酸保守区域设计简并引物,扩增出甘薯编码类胡萝卜素合成关键酶PDS的基因(pds)cDNA中间片断。通过5'-RACE和3'-RACE技术进行cDNA末端的快速扩增,成功地克隆了pds的全长cDNA。序列分析表明,pds基因的全长cDNA序列长度为2128 bp,编码572个氨基酸,与其他植物的序列高度同源。     

乌鳢（Channa argus）干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子的克隆与特征分析

应用抑制差减杂交、末端快速扩增和基因步移技术,克隆并鉴定了乌鳢干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子序列.Viperin cDNA全长1474nt,包含1059nt的开放阅读框,编码352个氨基酸.除N末端70个氨基酸外,Viperin蛋白氨基酸序列在鱼类和哺乳类具有高度的保守性.ISG15 cDNA全长758nt,包含468nt的开放阅读框,编码155个氨基酸,含有两个泛素样(UBL)结构域,C末端具有保守的UB偶联结构(LRGG).Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件(ISRE)和γ-干扰素激活序列(GAS).ISRE是干扰素刺激基因启动子区的重要特征,并与干扰素调控因子(IRF)1和IRF2的识别序列(IRF-E)部分重复;GAS参与介导II型干扰素激活基因的诱导转录.Viperin启动子区还包含保守的NF-κB结合位点,这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式(GGGRNNYYCC)出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道.此外,Viperin和ISG15启动子尚存在TATA,CAAT,Sp1等转录因子结合位点.乌鳢ISG15基因5′非编码区含有单一的内含子,而Viperin基因5′非编码区未发现内含子.Viperin和ISG15mRNA主要表达在头肾、后肾、脾脏和鳃,肝脏中也有少量表达.体内干扰素诱导剂polyI:C刺激后,Viperin和ISG15基因在肝脏的表达水平明显增加.     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

单向聚合酶链式反应扩增法研究

cDNA的末端快速扩增（RACE）是获得全长cDNA的有效手段之一。本文论述了RACE技术的原理、方法和改进,并介绍了新型RACE技术。     

猪黑皮质素受体3和4基因克隆及分析

以长白猪(Landrace)大脑cDNA为模板,克隆长白猪黑皮质素受体3和4基因(MC3R和MC4R).序列分析显示:长白猪MC3R基因cDNA编码具319个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠和斑马鱼的氨基酸序列一致性分别为86.4%、83.3%、82%和69.7%;MC4R基因cDNA全长1175bp,编码具332个氨基酸的前体蛋白,与人、大鼠、小鼠的氨基酸序列一致性高达94%以上,与斑马鱼MC4R氨基酸序列享有70.7%的同源性.序列分析显示,猪MC3R和MC4R基因都具有典型的七次跨膜结构域,和短的胞内环和胞外环,且在第五个跨膜域中保守的甲硫氨酸(M)分别替换为异亮氨酸(I)和缬氨酸(V).另外,在猪MC3R和MC4R中还鉴定到保守的半胱氨酸残基,第一个胞内环中保守的PMY基序和N末端的3个N-链接糖基化位点.组织表达图谱分析表明,MC3R主要在大脑和脾中高表达,而MC4R主要在六种检测的组织中都有表达,在肾中表达较弱.     

用^13C核磁共振测定高聚物分子量：PE分子量的测定

提出应用~(13)C核磁共振(NMR)方法测定聚合物分子链末端浓度来求数均分子量M_n的问题。具有不同分子量的聚乙烯(PE)在~(13)C-NMR谱上,主链亚甲碳原子,各种支化链结构以及接近链末端和末端的碳原子将显示出各自的不同强度的特征峰。考虑了影响~(13)C-NMR谱定量性的因素,通过谱强度计算出一系列经分级后PE各级分的数均分子量M_n,与GPC的测定结果基本一致,探讨了~(13)C谱测定M_n的可能性和准确性。     

虫荧光素酶N末端缺失

目的是通过虫荧光素酶Ｎ末端氨基酸的缺失,研究缺失对酶活性的影响。采用聚合酶链式反应的方法,构建虫荧光素酶Ｎ－末端缺失７,８,９个氨基酸残基的突变体,导入大肠杆菌ＤＨ５α菌株中直接得到表达,再分离纯化粗酶,并检测酶活。结果表明,Ｎ末端缺失７个氨基酸的突变体几乎没有活性（小于天然活性的０．５％）,Ｎ末端缺失８个以上氨基酸残基的突变体则完全丧失活性。由于Ｎ末端缺失６个氨基酸的突变体保持了７７％的酶活性,因而萤火虫荧光素酶Ｎ末端第７个氨基酸与酶的催化活性密切相关。     

毕赤酵母△~9-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ9-脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行PCR,获得一个741 bp的毕赤酵母cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′和5′序列,从而得到全长为1 689 bp的cDNA序列.序列分析结果表明,该序列具有一个长度为1 194 b p、编码397个氨基酸的开放阅读框(PPD9).与报道的Δ9-脂肪酸脱氢酶一样,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和疏水结构,在其氨基酸序列的C-末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区.该序列为一个新的编码Δ9-脂肪酸脱氢酶的基因,为了验证其功能,把开放阅读框序列PPD9亚克隆到表达载体pYES 2.0,构建重组表达载体pYPPD9,并转化到酿酒酵母的Δ9-脂肪酸脱氢酶缺陷型菌株DTY-11A中进行表达。通过平板互补实验结果表明,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的蛋白具有Δ9-脂肪酸脱氢酶活性,能弥补DTY-11A中由于Δ9-脂肪酸脱氢酶的缺失而引起的致死性突变。     

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot) 花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA 核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE 和3′RACE 技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因（AmCHS）cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸。其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS 具有的活性位点和催化位点等保守性位点.     

HER-2基因特异性核酶设计与体外转录载体构建

目的 构建人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性核酶(ribozyme,RZ)及其底物基因的体外转录载体.方法 设计合成RZ基因,将该RZ克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,测序鉴定.应用Trizol试剂提取MDA-MB-453细胞总RNA,RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段,同样插入载体pcDNA3.1( ),测序鉴定.结果 经DNA测序分别证实合成的RZ基因序列和通过RT-PCR扩增的HER-2 cDNA序列克隆入pcDNA3.1( )中.结论 构建HER-2特异性RZ真核表达载体及含有HER-2 cDNA的载体,有助于进一步研究RZ对靶基因切割作用及雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER-2信号转导通路.     

一种改进的小非编码RNA cDNA文库构建方法

本文使用RNA Antisense Purification(RAP)技术富集纯化sncRNA,有效去除了5S、5.8SrRNA.联合使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)和RNA 5′Polyphosphatase处理sncRNA,将5′-端为非单磷酸结构的sncRNA转变成单磷酸结构,增加了文库覆盖率.在sncRNA3′-端添加poly(A)尾结构以及使用oligo(dT)16VN-adapter锚定引物进行逆转录,间接解决了sncRNA 3′-端接头定向连接问题,不再使用价格昂贵的腺苷化接头.改进后的sncRNA cDNA文库容量为3×105cfu,重组率为95%,且测序结果显示,获得的cDNA序列具有较好的完整性.使用这种成本低且行之有效的改进方法,为深入研究sncRNA奠定了基础.     

阅读框架内乳腺癌cDNA文库的构建

目的:为构建高质量乳腺癌噬菌体展示文库,用pKE-2质粒载体经卡那抗性筛选富集开放阅读框架(open-reading frame ORF)内阳性克隆。方法:用Trizol试剂提取乳腺癌组织总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoR/Hind接头,用EcoR和Hind消化接头,使形成两端分别带有EcoR和Hind粘性末端的双链cDNA,将其连接于带有EcoR和Hind末端的pKE-2质粒载体,转化大肠杆菌DH5α,经卡那抗性筛选,富集ORF克隆。结果:经过ORF筛选,文库中ORF克隆比例达到80%,较筛选前的5%提高75%。     

树鼩PD-1基因的分离、鉴定及表达分析

PD-1(Programmed cell death 1)是一种抑制性的受体,是免疫球蛋白超家族的成员.大量研究证明PD-1能被诱导而在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT 细胞和单核细胞上表达,从而在慢性感染的病因学中起着重要作用.树鼩(Tupaia belangeri)做为一个理想的模型可被应用于许多人类感染性疾病如乙型病毒性肝炎.为了充分利用树鼩对于感染性疾病的宿主免疫应答模型,我们分离出树鼩PD-1基因.利用迅速扩增cDNA末端PCR(RACE-PCR)技术,从树鼩脾组织中克隆了PD-1基因的全长cDNA序列.序列分析显示树鼩PD-1 cDNA 的开放阅读框编码一个由242个氨基酸组成的跨膜蛋白,并且和人类、灵长类和啮齿类中的同源基因有高度相似性.组织分布分析表明在所检测的几种组织中PD-1基因只在脾中表达.此外,淋巴细胞刺激实验显示,利用PMA和ionomycin刺激新鲜分离的树鼩外周血单核细胞(PBMCs)能够诱导PD-1 mRNA水平上的表达.我们的结果为将来进一步探讨树鼩的免疫功能提供了良好的基础.     

含联苯结构环氧树脂/蒙脱土纳米复合材料的制备及其固化反应动力学

采用含联苯结构环氧树脂3,3＇,5,5＇-四甲基联苯二酚二缩水甘油醚(TMBP)与层间距为2.33 nm的有机蒙脱土(O-MMT)进行插层复合,并选用芳香型固化剂4,4 ＇-二氨基二苯甲烷(DDM),制备了TMBP/DDM/MMT纳米复合材料.采用非等温差示扫描量热法(DSC)研究该体系的固化反应动力学,求得其表观活化...     

鸭跖草Commelina communis中差异表达cDNA 片段的克隆与分析

一种新的基因克隆技术称为抑制消减杂交技术(SSH)用于研究生长于2种生态环境(古铜矿山和正常土壤)中鸭跖草Commelina communis的基因表达差异.分别以Cu矿山鸭跖草作为检测子,非Cu矿山鸭跖草作为驱赶子,建立了生长于Cu矿山生态环境中鸭跖草的差异表达cDNA文库,此cDNA文库代表在Cu矿山鸭跖草中特异表达的cDNA.通过反式Northern杂交筛选出3个阳性克隆进行测序.序列分析表明其中一个cDNA为CaM-1ike基因.进一步对此基因进行Virtual Northern分析,结果初步表明此基因在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上调表达.     

左手螺旋Z-DNA的研究:人工合成的Oligod(G—C)_n在PAGE中的异常泳动行为

为研究DNA的B,Z构象的相互转换,我们人工合成了dG-dC交替互补顺序的六聚体与十二聚体,在用PAGE法纯化过程中,发现5',3'-末端为双羟基的寡聚体的泳动速率是d(G-C)_3>d(G-C)_2>d(G-C),5'—末端带磷酸基的相应寡聚体的泳动速率则是:d~*(G-C)>d~*(G-C)_2>d~*(G-C)_3,二者行为正好相反,而5',3'—末端为双羟基的d(G-C)_5与d(G-C)_6和5'—末端带磷酸基的十聚与十二聚体在PAGE中的泳动行为是一致的。由此推测5',3'—末端为双羟基的寡聚体在PAGE中的异常行为的转折点在六聚到十聚之间。