油菜花粉钙结合蛋白的研究

以油菜花粉(Brassica campestris)为材料纯化了钙调素(CaM),并得到一种新钙结合蛋白(NCBP)。经SDS-PAGE、PAGE和等电聚焦电泳(IEF)鉴定,这两种蛋白质均表现均一。CaM分子量为18.8kD, NCBP为16.3kD,等电点分别为3.6和4.2。研究证明花粉CaM具有与其他来源CaM所特有的性质,对环核苷酸磷酸二酯酶(简称PDE)有明显的激活作用,而花粉NCBP不明显。花粉CaM在PAGE和SDS-PAGE中电泳行为有Ca²⁺效应,而NCBP仅表现在PAGE中。经氨基酸组成分析表明两种蛋白质氨基酸组成不同,但均含有较多的酸性氨基酸,不含Trp, 含1个Cys。CaM和NCBP N-端均为封闭,CaM C-端为-Met-Ala-Lys-COOH。两种蛋白质具有不同的肽谱和CD谱。用DTNB修饰花粉CaM Cys残基,则激活PDE的能力明显下降。     

钙——钙调素热激信号转导途径研究进展

植物细胞内存在一条新的热激信号转导途径.热激引起细胞内自由钙离子浓度([Ca2+];)迅速上升,而磷脂酶C/1,3,5-三磷酸肌醇(PLC/IP3)信号系统的参与是热激引起[Ca2+]i升高的因素之一.热激也提高钙调素(CaM)基因表达和CaM蛋白的积累,钙调素基因AtCaM3是Ca2+-CaM热激信号转导途径中的重要成员.钙调素下游信号分子研究表明:AtCaM3通过CaM结合的蛋白激酶AtcBK3或CaM结合的蛋白磷酸酶AtPP7改变热激因子AtHSFAla的磷酸化状态以调节AtHSFAla的活性,进而影响热激蛋白基因的表达,最终影响植株的耐热性.     

钙调素通过HSP70调控热激转录因子的活性

凝胶阻滞分析结果显示,70kD的热激蛋白(HSP70)抑制热激转录因子(HSF)的DNA结合活性;利用免疫共沉淀法在细胞提取液中检测到了CaMHSP70复合物的存在,并且热激后CaMHSP70复合物含量增加.表明钙调素(CaM)调控HSF活性可能是通过与HSP70结合起作用.     

一氧化氮可能参与细胞外钙调素诱导蚕豆气孔关闭的过程

细胞外钙调素(CaM)被发现能够调节蚕豆及拟南芥气孔运动,而且G蛋白、H_2O_2及Ca~(2 )参与这一过程．从接受刺激到引起气孔关闭保卫细胞要经历复杂的信号转导,因此细胞外CaM调控气孔运动的信号转导途径还需要深入探讨．研究中以蚕豆下表皮条为材料,用表皮条生物分析和荧光显微技术研究了一氧化氮(NO)在细胞外CaM促进气孔关闭过程中的作用．结果表明:细胞外CaM能诱导保卫细胞内NO升高,一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N~G-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)和NO清除剂2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)抑制了这一过程,而硝酸还原酶(NR)抑制剂NaN_3则没有抑制作用;L-NAME和PTIO也抑制细胞外CaM诱导的气孔关闭过程,而NaN_3不能抑制这一过程．说明细胞外CaM主要通过NOS途径诱导NO合成,从而诱导气孔关闭．质膜Ca~(2 )通道抑制剂及Ca~(2 )螯合剂处理实验结果表明,细胞外CaM对保卫细胞内NO的诱导过程依赖Ca~(2 )内流．文中结果为NO参与细胞外CaM调节气孔运动的过程提供了直接证据．     

钙-钙调素热激信号转导途径研究进展

植物细胞内存在一条新的热激信号转导途径．热激引起细胞内自由钙离子浓度（[Ca^2＋]i）迅速上升,而磷脂酶C／1,3,5一三磷酸肌醇（PLC／IP3）信号系统的参与是热激引起[Ca^2＋]i升高的因素之一．热激也提高钙调素（CAM）基因表达和CaM蛋白的积累,钙调素基因AtCaM3是Ca2＋-CaM热激信号转导途径中的重要成员．钙调素下游信号分子研究表明：AtCaM3通过CaM结合的蛋白激酶AtCBK3或CaM结合的蛋白磷酸酶AtPP7改变热激因子AtHSFAla的磷酸化状态以调节AtHSFAla的活性,进而影响热激蛋白基因的表达,最终影响植株的耐热性．     

东海原甲藻钙调蛋白的分离纯化及鉴定

以东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)为材料,经热变性、离心处理,上清液依次经DEAE纤维素阴离子交换层析和苯基-Sepharose CL- 4B疏水层析分离纯化钙调蛋白(CaM).SDS-PAGE和Western blot检测结果显示:东海原甲藻中CaM的相对分子质量为16 ku.采用该实验方法首次有效地从海洋浮游植物东海原甲藻中分离纯化出钙调蛋白.     

金属离子竞争结合钙调素的电化学行为研究

为了探讨金属离子与Ca~(2+)对钙调素(CaM)的竞争结合作用,在pH值为6.5含2mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.15 mol/L的NaCl溶液中,用交流阻抗法研究了金属离子如Ca~(2+),Cd~(2+),Al~(3+),Fe~(3+)结合及竞争结合钙调素的电化学行为。结果表明:金属离子与CaM的结合能力可以通过溶液中[Fe(CN)_6]~(3-/4-)在钙调素自组装膜修饰金电极上的电化学反应电阻的变化来判断,Ca~(2+),Cd~(2+)和Al ~(3+)都能与CaM结合,Fe~(3+)不能与CaM结合,且Ca~(2+)与CaM结合能力要比Al 3+强;Ca~(2+)在CaM上的结合位点与Cd~(2+)相同,与Al~(3+)不同。交流阻抗法为研究金属离子与CaM的竞争结合行为提供了一个新方法。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

Ca2+、CaM及CaM拮抗剂对粟酒裂殖酵母质膜H+-ATP酶活性的影响

经差速离心,酸处理,蔗糖密度梯度离心制备粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）质膜H^＋-ATP酶,以研究Ca^2＋、CaM以及CaM拮抗剂对纯化的质膜H＋-ATP酶活性的影响.结果表明Ca^2＋强烈的抑制该酶的活性,而CaM对该酶的活性没有影响,但TFP与Compound R24571这两类CaM拮抗剂又都能强烈地抑制该酶的活性.推测TEP等抑制该酶的活性不是通过与CaM结合作为CaM的拮抗剂竞争性抑制该酶的活性,而是直接对该酶发生作用或者通过磷脂或其它的CaM依赖性的膜蛋白间接对该酶产生作用.     

Neuritin野生型蛋白的制备及活性、稳定性的检测及分析

目的 制备符合药典结构要求的无标签Neuritin野生型(wild type,WT)蛋白,并完成其存在形式、活性及稳定性鉴定及分析。方法 利用基因重组技术构建符合药典结构要求的Neuritin WT酵母重组子,利用SDS-PAGE还原电泳及Western blot对其进行高表达筛选及鉴定;摸索建立无标签Neuritin WT蛋白纯化方法,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE还原电泳分子量鉴定、Western blot免疫原性鉴定、SEC-HPLC精细鉴定及宿主DNA、宿主蛋白残留量检测;利用SDS-PAGE非还原电泳完成存在形式的鉴定;通过参照药典建立的重组Neuritin蛋白活性鉴定方法,检测并分析Neuritin WT纯化蛋白的活性,并观察37℃下不同时间Neuritin WT纯化蛋白的稳定性。结果 制备了纯度高达98%以上的Neuritin WT纯化蛋白,蛋白相对分子质量为9.7 kDa,宿主DNA残留量为0.009 4 ng/剂,宿主蛋白残留量占比0.000 8%;经检测,该纯化蛋白存在单体、二聚体2种形式。活性鉴定结果表明该蛋白具有维持神经元存活的生物学活性;且37℃下3 d内...     

动物体液中的胞外钙调素结合蛋白（快报）

利用以生物素标记钙调素为探针的凝胶覆盖技术检测动物体液中胞外钙调素结合蛋白（ＣａＭＢＰ）。结果，人的唾液中检测到至少３种分子量分别为１４ｋＤ，２４ｋＤ和５２ｋＤ的ＣａＭＢＰｓ。其中，５２ｋＤ蛋白与ＣａＭ的结合依赖于Ｃａ２＋的存在，而２４ｋＤ和１４ｋＤ蛋白则不依赖于Ｃａ２＋。在鸡血清里，检测到以９４ｋＤ，４４／４５ｋＤ蛋白为主的４～５种胞外ＣａＭＢＰｓ，所有的这些蛋白与ＣａＭ的结合都依赖于Ｃａ２－。此外，在牛奶中也检出胞外ＣａＭＢＰｓ。以上结果，证明了在动物中普遍存在胞外ＣａＭＢＰｓ，为胞外钙调素的作用机理提供了新线索。     

钙调素拮抗剂对荷瘤小鼠主要器官钙调素（CaM）水平的影响

本文采用磷酸二酯酶（ＰＤＥ）法,测定了小檗胺衍生物ＥＢＢ对荷Ｓ１８０瘤小鼠的主要器官和瘤体ＣａＭ含量的影响。实验结果表明,ＥＢＢ具有使荷瘤后小鼠脑、肺、肝、脾、肾五个主要器官ＣａＭ由不正常趋向正常的能力,而已知抗肿瘤药物丝裂霉素和环磷酰胺单独使用时此种能力较弱,但这两种抗肿瘤药物与ＥＢＢ联合作用时,能使荷瘤鼠诸器官的ＣａＭ水平趋向正常。结果提示,专一性强的ＣａＭ拮抗剂在抑制肿瘤的同时可能还具有维护     

钙调素参与植物线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）活性调节的研究

对纯化的玉米线粒体ＳＤＨ进行ＣａＭ含量测定电泳分析，对ＮＡＤＫ的激活及外源ＣａＭ对ＳＤＨ活性的影响研究，结果表明：ＳＤＨ中可能含ＣａＭ亚基，并且ＳＤＨ活性可能受Ｃａ（２＋）·ＣａＭ调节．     

Localization of calmodulin and calmodulin-like protein and their functions in biomineralization in P. fucata

Calmodulin （CAM） and calmodulin-like protein （CaLP） are two proteins involved in biomineralization. Their localizations in Pinctada fucata mantle epithelia were studied by Western blot （WB） analysis of the nuclear/cytosol fraction of primary cultured P. fucata mantle cells and immunogold electron microscopy. The results showed a completely different distribution of these two proteins at the subcellular level. CaM was distributed throughout both the nucleus and cytoplasm of the mantle epithelium but CaLP was distributed only in the cytoplasm. The functions of these two proteins in biomineralization were investigated by shell regeneration. During this pro- cess, the expressions of CaM and CaLP were greatly enhanced in different organelles of the mantle epithelium. Overexpression of these two proteins and a mutant of calmodulin-like protein （M-CaLP） that lacks an extra C-terminal tail in MC3T3-E1 promoted the mRNA expression of osteopontin, a biomineralization marker for osteoblasts. All of the results indicated that CaM and CaLP have completely different distributions in the mantle epithelium and affect the biomineralization process at different levels. The extra C-terminal tail of CaLP is important for its functions in biomineralization in P. fucata.     

Localization of calmodulin and calmodulin-like protein and their functions in biomineralization in P. fucata

Calmodulin (CaM) and calmodulin-like protein (CaLP) are two proteins involved in biomineralization. Their localizations in Pinctada fucata mantle epithelia were studied by Western blot (WB) analysis of the nuclear/cytosol fraction of primary cultured Pinctada fucata mantle cells and immunogold electron microscopy. The results showed a completely different distribution of these two proteins at the subcellular level. CaM was distributed throughout both the nucleus and cytoplasm of the mantle epithelium but CaLP was distributed only in the cytoplasm. The functions of these two proteins in biomineralization were investigated by shell regeneration. During this process, the expressions of CaM and CaLP were greatly enhanced in different organelles of the mantle epithelium. Overexpression of these two proteins and a mutant of calmodulin-like protein (M-CaLP) that lacks an extra C-terminal tail in MC3T3-E1 promoted the mRNA expression of osteopontin, a biomineralization marker for osteoblasts. All of the results indicated that CaM and CaLP have completely different distributions in the mantle epithelium and affect the biomineralization process at different levels. The extra C-terminal tail of CaLP is important for its functions in biomineralization in Pinctada fucata.     

钙离子拮抗剂治疗高血压病患者过程中细胞内外钙调素水平的变化

从分子水平研究钙离子拮抗剂治疗高血压病的机制。用反转录聚合酶链反应法测定淋巴细胞内钙调素（ＣａＭ）基因的ｍＲＮＡ转录水平以及用ＲＩＡ法测定细胞外（即血清）ＣａＭ浓度,借以观察在用钙离子拮抗剂治疗高血压的过程中,细胞内外ＣａＭ水平的改变。发现随着正规服用钙拮抗剂治疗时间的延长,高血压患者淋巴细胞内ＣａＭ基因ｍＲＮＡ的转录水平亦受到抑制。服用钙拮抗剂时间长于３个月者,ｍＲＮＡ的转录水平显著降低（Ｐ＜０．０１）,而治疗时间在１个月之内者,ＣａＭ基因的转录水平无明显变化（Ｐ＞０．０５）。对于细胞外ＣａＭ的水平,在服用钙拮抗剂治疗时间＜１个月者,血清ＣａＭ浓度下降,而长期服用钙拮抗剂的患者则相对增高,但均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。在用钙拮抗剂治疗高血压的过程中,细胞内和细胞外ＣａＭ的水平均发生变化。用钙离子拮抗剂治疗高血压病长于３个月者,细胞内ＣａＭ基因的ｍＲＮＡ转录水平明显受到抑制,而细胞外ＣａＭ浓度则无论服用钙离子拮抗剂时间长短,变化均不显著     

番茄碱对棉铃虫毒性分析

本文主要研究了番茄碱对棉铃虫的毒性作用．实验结果表明：（1）用不同浓度的番茄碱（tomatine）浸泡的棉花叶饲喂棉铃虫时，随浓度的增加及时间的延长，对棉铃虫的杀伤力增强．结果显示：饲喂第三天时，1mmol／L的浓度引起48％死亡，2mmol／L时60％死亡，4mmol／L时76％死亡，其IC50为1．78mmol／L．（2）用紫外光谱分析测得虫体内钙调蛋白的含量，结果显示：tomatine对其体内钙调蛋白的影响较大，随tomatine浓度的增加，钙调蛋白的含量逐渐降低．（3）紫外光谱图谱显示：番茄碱与钙调蛋白形成了一种新的物质（其特征吸收峰在190nm-220nm）．说明tomatine对棉铃虫的杀伤作用与钙调蛋白有关，此项研究为进一步探讨tomatine的作用分子机制提供了科学参数．     

Effects of extracellular calmodulin on pollen germination and tube growth

The effects of calmoddin (CaM) antagonist W7-agarose, anti-CaM serum and exogenous purified CaM on pollen germination and tube growth ofForsythia suspensu were studied. The pollen germination and tube growth were inhibited or completely stopped by CaM antagonist W7-agarose. The addition of exogenous purified CaM stimulated pollen germination and tube growth, whereas the same amount of bovine serum albumin (BSA) had no effect. The inhibitory effects caused by W7-agarose and anti-CaM serum could be reversed completely by the addition of exogenous purified CaM. The tube growth of germinated pollen was also inhibited or completely stopped by W7-agarose. The results suggest that endogenous extracellular CaM initiates pollen germination and tube growth, whereas exogenous CaM enhances the above processes.