酶消化法和匀浆法获得河蟹游离精子的比较研究

在pH 7.4的条件下，以不同的温度（27 ℃,32 ℃,37 ℃,42 ℃和47 ℃）、酶浓度（0.05 %,0.10 %,0.15 %,0.20 %和0.25 %）和酶作用时间（5 min,10 min,15 min,20 min和25 min），通过正交试验，研究了胰蛋白酶消化中华绒螯蟹精荚获得游离精子的最佳反应条件.以每克精荚获得的精子数量为判据，发现酶作用时间是主要的影响因子，其次是温度和酶浓度.酶消化的最适反应条件是：温度为37 ℃，酶浓度为0.20 %，作用时间为5 min.酶消化法与机械匀浆法的比较研究发现，酶消化法从每克精荚中获得的精子量为7.41×108个，显著高于匀浆法，且精子的死亡率为4.75 %，显著低于匀浆法.此外，用人工诱导顶体反应法进一步检测酶消化法以及机械匀浆法所获得精子的顶体反应能力，酶消化法获得精子的顶体反应率为62.3 %，而匀浆法为64.5 %，两者无显著性差异.结果表明，酶消化获得游离精子的方法明显优于机械匀浆法.     

应用流式细胞术研究乳腺癌MCF-7细胞周期同步化

目的筛选出适宜的血清及秋水仙碱的作用浓度及时间,使乳腺癌MCF-7细胞分别达到G0/G1和G2/M期同步化。方法采用血清饥饿法诱导MCF-7细胞G0/G1同步化,秋水仙碱诱导细胞G2/M期同步化,流式细胞仪检测细胞各期分布情况。结果处理24 h后,1%血清浓度组G0/G1期细胞分别达到(72. 96±0.84)%,1. 0μg/mL秋水仙碱处理组G2/M期细胞分别占总细胞数(73. 67±1. 77)%。处理36 h后,1%血清浓度及秋水仙碱实验组细胞发生凋亡。结论MCF-7在血清浓度为1%处理24 h后完成G0/G1同步化,在1. 0μg/mL的秋水仙碱处理24 h后完成G2/M期同步化。     

虹膜色素上皮细胞移植治疗视网膜色素上皮细胞变性

目的 研究自体虹膜色素上皮细胞(Iris Pigment Epithelium,IPE)移植治疗视网膜色素上皮细胞变性的效果.方法 采用酶-机械分离-酶消化法法获取高纯度、高活力的RPE细胞用于移植,采用外路法将IPE细胞悬液移植入视网膜下腔. 结果 IPE移植术后患者眼底移植区色素沉着减少,未见渗出,出血,视网膜平,视力从入院时的0.15提高至术后2W的0.2.多焦ERG显示移植区P1波平均反应密度上升.结论 IPE细胞移植有望成为RP治疗的一新方法.     

肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期细胞蛋白质组表达差异的研究

通过TdR(胸腺嘧啶核苷)调控人肝癌细胞株HepG2的细胞周期,运用双向电泳-图像分析-质谱技术研究肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期全细胞蛋白质组表达的差异,探索参与肝癌细胞株HepG2的G1期、G2/M期调控相关的蛋白.以TdR诱导肝癌细胞株HepG2,分别得到同步化的G1期、G2/M期细胞,流式细胞术检测.采用比较蛋白质组学的研究技术(双向电泳、质谱分析)筛选G1期、G2/M期差异表达的蛋白质.结果流式细胞术检测显示TdR诱导后,分别获得(63.62±2.82)%的G2/M期同步化细胞,(75.24±0.17)%的G1期同步化细胞,通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到21个差异表达的蛋白.其中G2/M期表达,G1期未见表达有10种蛋白;存在三倍以上的差异点11个:2种在G2期表达上调,9种在G1期表达上调.说明TdR阻断法能够获得很好的同步化细胞.质谱鉴定得到的这些差异表达的蛋白质涉及到细胞周期调控、DNA结合、转录调控、mRNA剪接、肽链合成起始、折叠以及细胞代谢等方面.     

过表达maspin对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

通过构建maspin表达质粒,在人乳腺癌MCF-7细胞中过表达maspin,研究maspin对MCF-7细胞增殖率及凋亡率的影响.MTT检测实验表明,过表达maspin能够剂量依赖性抑制MCF-7细胞的增殖率.采用TUNEL法和流式细胞术检测maspin对MCF-7细胞凋亡的影响,结果表明过表达maspin可促进MCF-7细胞凋亡进而抑制其增殖.     

重组hFGF-7腺病毒对角质形成细胞的生物学效应

目的:研究重组腺病毒导入人成纤维细胞生长因子7(hFGF-7)对人皮肤角质形成细胞(HaCat)的生物学效应.方法:通过倍比稀释和感染实验,测定重组腺病毒rAd-hFGF-7的滴度;流式细胞术检测重组腺病毒感染HaCat细胞的感染效率;MTT法检测rAd-hFGF-7对HaCat细胞增殖的影响;重组腺病毒对HaCat细胞周期的影响通过流式细胞术进行检测.结果:高滴度重组腺病毒可高效感染HaCat细胞,其促细胞增殖作用随着重组腺病毒MOI值的增加而增强,当MOI值为50时,感染细胞进入S期和G_2期的细胞比率显著增加.结论:重组腺病毒rAd-hFGF-7可促进HaCat细胞的增殖,改变HaCat细胞周期.     

刺槐体细胞胚发生的同步化调控

为了建立一个高频率、同步化发生的体细胞胚培养系统,以二倍体刺槐为材料,对影响刺槐体细胞胚同步化发生的培养基渗透压、培养基中添加的植物生长调节剂、低温等培养环境条件以及悬浮培养结合看护培养方法进行了研究,建立了刺槐体细胞胚同步发生体系.结果表明:1)4 ℃低温条件下处理7 d的胚性愈伤组织,最有利于刺槐体细胞胚的同步化诱导,同步化率可达37.3%;2)培养基中蔗糖质量浓度为50 g/L最适宜调控刺槐的体细胞胚同步化发生,同步化率可达35.0%;3)培养基中的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)质量浓度为0.1 mg/L时最适宜体细胞胚同步化的调控,体细胞胚发生的同步化率可达43.6%,同时对畸形胚的发生有较好的控制作用;4)将悬浮培养的胚性细胞用50目筛(孔径0.28 mm)过滤,将留在筛上的细胞团接种到铺有滤纸的半固体体细胞胚诱导培养基上(培养基为MS(Murashige & Skoog)+NAA(naphthylacetic acid)0.5 mg/L+ BA(benzyladenine)0.5 mg/L+2-吗啉乙磺酸(MES)500 mg/L+谷氨酰胺 500 mg/L+水解酪蛋白500 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂3 g/L),培养21 d后,球形胚大量发生,占到总胚状体数目的67.3%.本结果可为其他植物种类的体细胞胚同步化调控研究提供参考.     

TdR诱导肝癌细胞株HepG2细胞周期同步化的效果

取对数生长期的 HepG2 细胞,加入含 TdR 的培养基 28 h 后,收集细胞,用 PBS 洗2次,加完全培养基,分别于 12 h 和24 h 收集各组细胞.用流式细胞术分析细胞周期各时相细胞百分数.探讨 TdR(胸腺嘧啶核苷)诱导人肝癌细胞株 HepG2 同步化后的细胞周期时相的变化.结果是TdR能较好地使肝癌细胞株Hepc2同步化于G1期和G2期.TdR诱导细胞后,分别于12中 h 获得(63.62±2.82)%的 G2/M 期同步化细胞,24 h 后获得(75.24±0.17)%的G1期同步化细胞.     

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.     

原代HUVECs分离培养关键影响因素分析

内皮细胞与心脑血管病变和癌症发生密切相关,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)是最佳的研究工具.针对影响原代HUVECs培养的主要因素提出解决办法,建立稳定可靠的原代HUVECs培养方法.方法是取自剖宫产手术的脐带,消化法分离HUVECs,M199培养传代.针对消化条件、培养液、培养瓶/板处理、传代时间、胰酶浓度等因素考察.结果表明培养瓶/板预先2%明胶包被,采用I型胶原酶分离消化,含10%胎牛血清的M199培养,24h后换液,细胞生长至紧密后传代,O.05%胰酶传代消化,取4～5代细胞用于实验.认为经过控制原代HUVECs培养的主要影响因素,建立了不易污染、纯活度高的原代HUVECs培养方法.     

三尖杉酯碱诱导HeLa细胞凋亡的研究

报道了三尖杉酯碱 (harringtonine ,HT)可以诱导HeLa细胞凋亡 .采用Heochst33342荧光染色、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞光度术 (FCM)的方法 ,研究了HT对HeLa细胞凋亡的影响 .利用细胞同步化技术和斑点杂交法研究发现 ,HT影响了HeLa细胞c myc和bcl 2基因的表达并且与细胞周期密切相关 .初步探讨其凋亡诱导的机制 ,认为HT通过在G1和G2 期下调细胞凋亡抑制基因bcl 2的诱导凋亡 ,以及下调c myc癌基因阻滞细胞增殖 ,并延迟凋亡发生 .这些结果对于了解HT的药物作用机制和提高临床化疗疗效具有重要意义 .     

诺丽果粉水溶液对MCF-7人乳腺癌细胞及其内源性VEGF影响

用诺丽冻干粉加入至不完全培养基中,培养人乳腺癌Mcf-7细胞,通过Cck-8、流式细胞术、TUNELDAPI染色等方法体外实验,比较不同处理方式下细胞的多方面生物学特性.Cck-8检测法的结果显示,经诺丽果粉水溶液处理细胞的Cck-8吸光值低于用不完全培养基培养细胞的吸光值,并且与作用时间呈负相关性.TUNEL-DAPI双染结果显示,经诺丽果粉水溶液处理的细胞凋亡率高于正常培养的细胞,并且凋亡率与浓度呈正相关性.流式细胞术检测结果显示,经过诺丽果粉水溶液处理的细胞在1 mg·m L~(-1)浓度下,24 h即会发生早期凋亡.酶联免疫吸附(Elisa法)检测内源性VEGF含量结果显示,经诺丽果粉水溶液处理后的细胞上清液中VEGF的含量:20,10 mg·m L~(-1)浓度下VEGF含量降低,5,2,1 mg·m L~(-1)浓度下VEGF含量升高.诺丽果粉水溶液对Mcf-7人乳腺癌细胞系有生长抑制作用,作用方式可能为阻碍VEGF与细胞结合.     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

黑木相思基因组DNA的快速提取

用SDS高盐介质法和1.5×CTAB法提取黑木相思幼叶及叶状柄基因组DNA,将其与2×CTAB法、3×CTAB法、改进的CTAB法进行比较,并用紫外光谱吸收、凝胶电泳、限制性内切酶消化、RAPD(Radomly Amplified Polymorphic DNA)和ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)等方法进行鉴定.结果表明,叶状柄多糖的质量分数较幼叶少,更易于基因组DNA的提取;SDS高盐介质法与1.5×CTAB法提取叶状柄的基因组DNA得率为180.0～697.5 μg·g-1,分子质量为48 kb,D(260)/D(280)=1.750～1.955,无需经Rnase 处理,可直接用于限制性酶切和RAPD及ISSR分析;1.5×CTAB法所提的基因组DNA的纯度优于SDS高盐介质法.综合考虑认为,1.5×CTAB法可作为黑木相思基因组DNA快速提取的简便方法.     

氨基化的介孔二氧化硅纳米材料与pDNA作用

采用共沉淀法合成高度有序、分散性良好的氨基化介孔二氧化硅纳米材料(Am-MSNs),并研究其吸附和保护质粒DNA(pDNA,PEGFP-N3)的性质,测定样品材料对A549和HeLa细胞的生物相容性.实验结果表明:Am-MSNs能有效吸附PEGFP-N3,并保护PEGFP-N3免受限制性内切酶的消化;Am-MSNs对A549和HeLa细胞表现出较高的生物相容性,当材料的质量浓度为125μg/mL时,两种细胞的存活率均约为100%.     

Ce(Ⅲ)盐与葡萄糖酸钠在3.5%NaCl溶液中对碳钢的缓蚀作用

采用失重法和动电位极化曲线法研究Ce(NO3)3、葡萄糖酸钠及其复合物在3.5% NaCl溶液中对碳钢腐蚀的抑制作用,用扫描电镜(SEM)对膜进行表征.结果表明:单独的Ce(NO3)3和葡萄糖酸钠对碳钢均为阴极型缓蚀剂,且缓蚀效率均随着缓蚀剂浓度的增加而增大,但缓蚀效率并不高.不同比例的Ce(NO3)3和葡萄糖酸钠之间均存在明显的协同作用,缓蚀效率约为90%;碳钢在含Ce(NO3)3和葡萄糖酸钠复合缓蚀剂的3.5% NaCl溶液中浸泡24h后表面形成了致密完整的保护膜.     

qking基因对大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

为探讨qking基因对大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac Fibroblast,CF)增殖及胶原合成的影响,进一步完善心肌纤维化的相关机制;为改善心机重构提供新的思路,采用胶原酶消化,差速贴壁法原代培养SD乳鼠心肌成纤维细胞,以血管紧张素II(AngII)诱导CF建立增殖及胶原合成模型,运用western-blot法,RT-PCR法,流式细胞术观察过表达qking对CF增殖及胶原合成的影响.结果在CF中血管紧张素II诱导了qking表达时间依耐性的降低,在24 h后降至谷底.过表达qking后通过western-blot法及RT-PCR法检测了CF中增殖细胞核抗原(PCNA)及胶原蛋白1a/3a表达水平的变化,流式细胞术观察细胞周期,数据表明qking基因编码的QKI-6蛋白亚型的过表达能明显抑制CF的增殖;而对于CF中胶原合成未见明显影响.说明qking基因编码的QKI蛋白对CF增殖发挥负性调节作用,但对胶原合成并无明显影响.     

长爪沙鼠不同组织基因组DNA的提取条件比较

目的建立长爪沙鼠基因组DNA的提取方法并对其脑、肝、肾和肌肉组织中的基因丰度进行比较。方法采用酚-氯仿法对不同消化温度和不同蛋白酶K浓度处理的各种组织提取DNA,比较其OD260/OD280值、DNA和蛋白质含量。结果提取DNA时温度和酶浓度对不同组织的DNA和蛋白质含量的影响不同。肾DNA样品中的蛋白质含量在低酶浓度组明显低于高酶浓度组,低酶浓度组的肾和肝DNA样品中的蛋白质含量均明显低于高酶浓度组。消化温度对提取肌肉组织的DNA含量影响较大,而从肾和肝组织中提取的DNA含量在37℃和50℃消化组之间没有差异。肝组织中的基因丰度最高,而肌肉组织中的基因丰度最低。结论提取DNA时,消化温度和酶浓度对提取不同组织的DNA和蛋白质含量有不同程度的影响。不同组织的基因丰度差异较大。     

固定化灵芝漆酶脱色氨基黑反应体系优化

采用响应面分析法,对固定化灵芝漆酶(Lac)降解氨基黑10B脱色反应体系进行优化分析.首先采用单因素实验分别获取反应体系中6个影响脱色率因素的最佳值;然后通过Plackett-Burman设计法对选取的6个影响因素进行筛选,确定主要影响因素为ABTS浓度和Lac酶量;再用最陡爬坡实验逼近ABTS浓度和Lac酶量2个主要因素的最大响应区域,并通过中心组合设计和响应面分析,确定2个主要影响因素的最佳值.优化后的氨基黑10B脱色200μL反应体系为:pH值4.6、温度30℃、ABTS浓度0.07mmol·L-1、硫酸铜浓度1.75mmol·L-1、Lac酶量6.23mg、初始底物浓度100mg·L-1.该反应体系氨基黑10B脱色率可达60.02%,比单因素法脱色率提高了44.46%.     

脐静脉内皮细胞的提取与形态学观察

目的 获取胶原酶灌注法提取脐静脉内皮细胞的有效方法.探讨内皮细胞培养过程中生长因子的添加浓度,并对内皮细胞进行形态学观察及鉴定.方法 采用血球计数法对在不同时间和不同胶原酶浓度下提取的脐静脉内皮细胞进行计数.同时采用MTT法探讨了生长因子(Endothe-lia Cells Growth Supplement,ECGS)的浓度对脐静脉内皮细胞生长的作用,并用倒置显微镜和HE染色法观察了脐静脉内皮细胞的形态,Ⅷ因子免疫组化对获取的脐静脉内皮细胞进行鉴定.结果 当提取时间为10～30 min时,随着时间的增加,内皮细胞的提取数量增加;当胶原酶的浓度为0.1%～0.3%时,消化的脐静脉内皮细胞数量逐渐增加.ECGS的浓度为30μg/mL时,促进脐静脉内皮细胞的生长,种植4天后细胞进入平台期.脐静脉内皮细胞体外培养形态为"铺路石"状.Ⅷ因子免疫组化鉴定为阳性.结论 胶原酶灌注法是一种快速而有效的获取血管内皮细胞的方法,可以为组织工程血管内皮化提供充足的种子细胞.