小鼠胚胎发育中期肝细胞增殖与凋亡

探讨小鼠胚胎中期肝发育过程细胞增殖与凋亡的变化规律、相关基因P21及Ki-ras在肝发育中的表达意义。在胚胎中期的小鼠肝组织中，采用免疫组织化学及切口末端标记法，可检测到小鼠肝发育过程中的细胞增殖与凋亡相伴存在，这与肝发育变化密切相关。用原位杂交的方法检测到P21时,Ki-ras基因在胚胎肝发育中期并没有表达，说明这两个细胞周期调控基因可能在胚胎肝发育中期并不起作用，而与其他的基因有关。     

小鼠胚胎发育中期肝细胞增殖与凋亡

探讨小鼠胚胎中期肝发育过程细胞增殖与凋亡的变化规律，相关基因P21及Ki-ras在肝发育中的表达意义，在胚胎中期的小鼠肝组织中，采用免疫组织化学及切口末端标记法，可检测到小鼠肝发育过程中的细胞增殖与凋亡相伴存在，这与肝发育变化密切相关，用原位杂交的方法检测到P21时，Ki-ras基因在胚胎肝发育中期并没有表达，说明这两个细胞周期调控基因可能在胚胎肝发育中期并不起作用，而与其他的基因有关。     

利用切片免疫荧光技术研究Tbx5在小鼠胚胎心脏中的表达

Tbx5参与转录因子的调控,对上肢及心脏发育起关键作用.通过对小鼠胚胎心脏组织切片厚度的选择、加入抗原修复液等试验条件的优化,建立了利用切片免疫荧光技术检测小鼠胚胎心脏中Tbx5的方法.结果显示,在胚胎发育的第11.5 d,Tbx5在整个心脏中都有表达,尤其在心房以及左心室中高表达.但在胚胎发育的第13.5 d,Tbx5只在心房和左心室中表达,在右心室中并不表达.揭示Tbx5的这种动态表达模式对于心脏的发育以及腔室分化是十分重要的.     

人类IRX1基因在肾脏维持高水平表达

从人类胚胎脑组织中提取总RNA,分离纯化mRNA,构建cDNA文库,以此文库为模板,用5'-RACE法获得人类IRX1 (HIRX1)的全长,其长度为2 054 bp.Northern blotting检测了HIRX1在胚胎时期和成体的表达情况,结果显示,HIRX1与小鼠6个IRX在胚胎心脏表达的情况大不相同,其在肾脏组织强烈表达,脑组织和肺其次,从胚胎各个时期到成体在肾脏组织都维持高水平表达,在肺组织维持较低水平表达,在脑组织只限制在胚胎时期表达,在心脏组织不管是胚胎还是成体时期都没有可检测水平,表明HIRX1可能参与脑、肺,特别是肾脏的发育,或者对此类器官功能的发挥起重要作用,与心脏的发育很可能没有相关性.     

ZNF382多克隆抗体的制备及其在蛋白质水平的表达研究

在筛选心脏发育相关新基因的研究时,本人克隆出了在人类心脏组织特异表达的基因-ZNF382,ZNF382在mRNA水平上的表达情况已经报道,为了阐明该基因在蛋白质水平的表达情况,本研究用质粒DNA注射小鼠法,生产制备得到抗ZNF382蛋白的多克隆抗体,胚胎原位抗体染色结果初步显示ZNF382蛋白主要在心脏和骨骼肌表达,其蛋白质表达水平与mRNA的表达水平基本一致,进一步表明该基因很可能参与心脏的形成或对心脏功能的发挥起重要作用.     

Smad2基因敲除小鼠冷冻胚胎库的建立

目的 建立Smad2基因敲除小鼠胚胎库。方法 利用OPS法对Smad2基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻保存,并比较不同杂交组合小鼠的超数排卵数、解冻胚胎的复苏率及发育率。结果 两组不同杂交组合（Smad2^＋/－♂×Smad2^＋/－♀和Smad2^＋／－×Smad2^＋／－♀）小鼠平均超排卵数分别为14．13枚和24．60枚;复苏率分别为90．16％和91．67％;囊胚发育率分别为73．08％和77．05％。这些结果表明Smad2基因敲除杂合子母鼠的超排数量明显低于野生型母鼠的超排数量,而二者胚胎解冻后的复苏率和囊胚发育率没有显著差异。因此我们主要通过对野生型小鼠超数排卵,然后与Smad2基因敲除杂合子雄鼠交配的方法获取胚胎,进行玻璃化冷冻保存,现已冻存胚胎1256枚。结论 成功建立了Smad2基因敲除小鼠胚胎库。     

LIM结构域蛋白KyoT基因剔除小鼠的建立和表型分析

KyoT为一LIM结构域蛋白,可与转录因子RBP-Jk相互作用而调节其转录活性.构建了KyoT基因剔除载体,转染小鼠胚胎干细胞(ES细胞)后得到同源重组的ES细胞克隆.将此ES细胞注射入小鼠的囊胚泡得到嵌合小鼠,再经小鼠培育得到KyoT基因被剔除的小鼠.纯合子KyoT基因剔除小鼠不能表达有功能的KyoT蛋白.表型分析表明纯合子KyoT基因剔除小鼠腹腔B1B细胞数增加,提示KyoT可能参与B淋巴细胞的发育.     

小鼠早期胚胎的全胚原位杂交技术

目的:探索一种适合于早期胚胎基因表达型检测的全胚原位杂交技术.方法:收集小鼠囊胚、固定;制备VASP、IL1R2基因特异性地高辛标记的cRNA探针;对囊胚进行杂交前处理、全胚原位杂交、抗体处理、显色以及显色后处理与镜检.结果:VASP、IL1R2特异性表达在囊胚的内细胞团细胞和滋养层细胞中.结论:小鼠早期胚胎全胚原位杂交技术适用于早期胚胎基因时空表达型的检测.     

GATA3对耳蜗发育和功能维持的作用

利用条件性基因敲除方法和免疫荧光技术,检测和分析了小鼠从胚胎到成体耳蜗柯蒂氏器中Gata3的表达.结果表明,Gfi1-cre可以高效敲除特定时期毛细胞内Gata3基因的表达.同时发现成体Gata3-Null的毛细胞数量减少且排列发生紊乱.提示转录因子GATA3在耳蜗毛细胞发育和结构维持中起着重要作用.     

基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立

目的 构建基于Cre- LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法 首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、 Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg (EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果 成功构建了基于Cre- LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL /6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg (EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5～15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论 成功建立运用Cre- LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。     

细胞的增殖与凋亡在胎肺支气管上皮细胞发育过程的观察

目的：观察不同发育阶段人胎肺支气管粘膜上皮细胞的凋亡,以及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达特征,并探讨细胞的凋亡与增殖在胎肺发育中的关系。方法：用原位核酸末端杂交,检测了１６～３２周人胎肺组织的凋亡细胞阳性表达率,用免疫细胞化学技术检测了同期人胎肺组织的ＰＣＮＡ阳性表达率。结果：人胎肺支气管粘膜上皮细胞在胎肺发育的早、中期（即假腺期和小管期）,细胞的凋亡与增殖均明显较晚期旺盛,而且两者均于胎肺发育的第２４周达到最高蜂,以后细胞的凋亡与增殖活动减弱;但凋亡与增殖细胞在不同发育时期定位有不同。结论：细胞的凋亡与增殖行为在胎肺支气管上皮细胞发育分化的整个过程中普遍存在,分工协作,对于胎肺的形态发生及功能完善共同起作用。     

KLF4沉默与阿霉素诱导的DNA损伤协同抑制肝癌HepG2细胞的生长

探究KLF4沉默与经不同作用浓度阿霉素处理诱导的DNA损伤对肝癌HepG2细胞增殖凋亡的影响及其作用机制.应用RNA干扰技术,采用siRNA转染HepG2细胞以沉默KLF4基因.采用MTT法检测KLF4沉默前后对HepG2细胞增殖的影响,使用流式细胞术检测KLF4沉默前后对HepG2细胞周期变化影响,应用Western blot法检测转染前后HepG2细胞中KLF4蛋白及细胞周期相关蛋白表达变化.Western blot检测到高浓度的阿霉素促进KLF4的表达,并且低浓度的阿霉素可使得细胞停滞在G2/M期,高浓度的阿霉素则使部分细胞凋亡(19.31%).将KLF4沉默后,发现细胞生长变缓,低浓度的阿霉素处理后,细胞随时间增加而出现更多的细胞凋亡;高浓度的阿霉素处理后,细胞数明显减少,更多的细胞发生凋亡(28.89%),且在KLF4沉默前后均发现低浓度阿霉素促进p53与p21表达,高浓度阿霉素抑制其表达.阿霉素诱导的DNA损伤可提高KLF4的表达,KLF4依赖于DNA损伤激活的p53促进p21的表达,进而引起G1/S期细胞周期阻滞.沉默KLF4与阿霉素诱导的DNA损伤可协同抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡,其在肝癌细胞 HepG2中扮演十分重要的角色.     

Survivin基因在胃癌组织中的表达及其与凋亡的相关性研究

目的研究胃癌组织中Survivin基因的表达及其与凋亡的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测30例正常胃粘膜及120例胃癌组织中Survivin基因的表达;采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）技术,检测其凋亡指数。结果30例正常胃粘膜组织Survivin基因均不表达,胃癌组织中Survivin阳性率为62．5％（75／120）,二者有显著性差异（P〈0．01）;Survivin基因表达与组织分化程度和TNM分期密切相关（P〈0．05）。胃癌组织凋亡指数（AI）和TNM分期、组织分化程度密切相关（P〈0．05）。Survivin基因表达水平与凋亡指数呈显著负相关（P〈0．01）。结论Survivin基因在胃癌的发生发展过程中可能起重要作用。Survivin基因的表达可抑制胃癌细胞凋亡、促进胃癌细胞增殖。     

Calcineurin sets the bandwidth for discrimination of signals during thymocyte development

At critical times in development, cells are able to convert graded signals into discrete developmental outcomes; however, the mechanisms involved are poorly understood. During thymocyte development, cell fate is determined by signals originating from the alphabeta T-cell receptor. Low-affinity/avidity interactions between the T-cell receptor and peptide-MHC complexes direct differentiation to the single-positive stage (positive selection), whereas high-affinity/avidity interactions induce death by apoptosis (negative selection). Here we show that mice deficient in both calcineurin and nuclear factor of activated T cells (NFAT)c2/c3 lack a population of preselection thymocytes with enhanced ability to activate the mitogen-activated protein kinase (Raf-MEK-ERK) pathway, and fail to undergo positive selection. This defect can be partially rescued with constitutively active Raf, indicating that calcineurin controls MAPK signalling. Analysis of mice deficient in both Bim (which is required for negative selection) and calcineurin revealed that calcineurin-induced ERK (extracellular signal-regulated kinase) sensitization is required for differentiation in response to 'weak' positive selecting signals but not in response to 'strong' negative selecting signals (which normally induce apoptosis). These results indicate that early calcineurin/NFAT signalling produces a developmental period of ERK hypersensitivity, allowing very weak signals to induce positive selection. This mechanism might be generally useful in the discrimination of graded signals that induce different cell fates.     

汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251的凋亡诱导作用

研究汉黄芩素对人神经胶质瘤细胞U251增殖和凋亡的影响,用不同浓度的汉黄芩素作用于U251细胞系,通过核染色观察形态变化,MTT检测细胞增殖抑制率,流式分析检测细胞的凋亡情况.结果显示,药物作用后的细胞,DAPI核染色呈致密浓染,并伴有凋亡小体的出现;MTT法测得U251细胞的增殖得到明显的抑制,抑制率随浓度和作用时间的增加而上升,其中作用24 h的IC50为145.87 μmol/L; Annexin V-FITC /PI流式细胞检测证实汉黄芩素确实可以诱导U251细胞凋亡,并有剂量依赖的性质;通过比色法证明在药物处理过的细胞中,凋亡标志性酶Caspase-3被激活,且活性随着药物浓度的升高而增强.研究表明,汉黄芩素能明显抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有抗神经胶质瘤的作用.     

Colorectal carcinomas in mice lacking the catalytic subunit of PI(3)Kgamma

Phosphoinositide-3-OH kinases (PI(3)Ks) constitute a family of evolutionarily conserved lipid kinases that regulate a vast array of fundamental cellular responses, including proliferation, transformation, differentiation and protection from apoptosis. PI(3)K-mediated activation of the cell survival kinase PKB/Akt, and negative regulation of PI(3)K signalling by the tumour suppressor PTEN (refs 3, 4) are key regulatory events in tumorigenesis. Thus, a model has arisen that PI(3)Ks promote development of cancers. Here we report that genetic inactivation of the p110gamma catalytic subunit of PI(3)Kgamma (ref. 8) leads to development of invasive colorectal adenocarcinomas in mice. In humans, p110gamma protein expression is lost in primary colorectal adenocarcinomas from patients and in colon cancer cell lines. Overexpression of wild-type or kinase-dead p110gamma in human colon cancer cells with mutations of the tumour suppressors APC and p53, or the oncogenes beta-catenin and Ki-ras, suppressed tumorigenesis. Thus, loss of p110gamma in mice leads to spontaneous, malignant epithelial tumours in the colorectum and p110gamma can block the growth of human colon cancer cells.     

依地福新抑制Jurkat细胞生长机制的研究

目的观察依地福新对体外培养的Jurkat细胞的生长抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法应用MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布;Annexin V—FITC染色法检测细胞凋亡率。结果不同浓度依地福新处理Jurkat细胞24～96h后,细胞增殖显著受到抑制,并呈现浓度及时间依赖性;1．0μmol／L、5．0ymol／L、10．0μmol／L依地福新处理72h后,Jurkat细胞G0／G1期细胞数量显著增加,S期细胞数量显著降低（P〈0．01）;各浓度组细胞凋亡率均显著增加（P〈0．01）。结论依地福新对Jurkat细胞具有生长抑制作用,其机制与阻滞细胞周期及诱导凋亡有关。     

六亚甲基二乙酰胺对粘液表皮样癌细胞P21和P53基因的转录激活作用

为了研究分化诱导剂六亚甲基二乙酰胺（hexamethylene bisacetamide,HMBA)在体外诱导人粘液表皮样癌细胞（MEC－1）时P^21（cip1/waf1),P^53基因调控的机理，从而为临床治疗提供理论依据。选用0．002mol/L HMBA和0．001g/L5-FU对培养的MEC－1细胞外诱导72h，分别采用光镜，TUNEL染色，免疫组化，图像分析等方法进行凋亡细胞的检测及P^21(cip1/waf1),P^53表达的定量分析，结果表明HMBA诱导的MEC－1细胞P^21(cip1/waf1)表达强度显著高于对照组（P＜0．01），P^53的表达强度显著低于对照组（P＜0．01），提示HMBA通过激活转录因子P^21(cip1/waf1)，P^53的表达而发挥对粘液表皮样品部细胞诱导分化，促进凋亡的作用。     

Epidermal growth factor stimulates guanine nucleotide binding activity and phosphorylation of ras oncogene proteins

Several human tumour cell lines contain genes that can transform NIH 3T3 cells into malignant cells. Certain genes have been classified as members of the ras oncogene family, namely, Ha-ras, Ki-ras or N-ras. The proteins encoded by the ras family are generally small (Ha-ras, for example, encodes a protein of molecular weight 21,000 named p21), and are associated with the inner surface of the plasma membrane. The only known biochemical property common to all forms of the ras proteins is the ability to bind guanine nucleotides, a property which may be closely related to the transforming ability of ras proteins. A GTP-dependent, apparent autophosphorylation (on threonine 59) activity has been identified only in the case of the v-Ha-ras protein. Although the role of these biochemical activities in the transformation process remains unclear, we have initiated studies to determine the possible biochemical interactions of ras proteins with other membrane components. We report here the evidence that epidermal growth factor enhances the guanine nucleotide binding activity of activated c-Ha-ras or v-Ha-ras p21, and phosphorylation of v-Ha-ras p21, suggesting that some mitogenic growth factors may regulate those activities.