亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择

以ZG1( )、ZG1(-)、ZG2( )、ZG2(-)、ZG3( )、ZG3(-)寡聚核苷酸片段为材料，合成了含有GCN4亮氨酸拉链蛋白基区结合DNA必需的35个氨基酸的折叠片段，将此片段分别克隆到pET3b质粒和pBLZ质粒中．酶切后用2％琼脂糖电泳检测证明两者克隆成功．将这2种重组质粒分别转化到E.coli DH5a中．发现pET3b重组体在E．coli DH5a中表达成功．而pBLZ质粒重组体在E．coli DH5a中不能成功表达；从转化子中分离得到重组质粒pET3b,酶切和序到分析都证明插入序列为合成的亮氨酸拉链蛋白基因．     

TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的：为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统；方法：设计PCR引物，将hbFGF的5’端前10个密码子突变，优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G C含量，通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆人pBV220质粒载体中，筛选出重组子，再通过温控法对重组菌体进行诱导，分析表达情况，并进一步纯化和测活；结果：bFGF在该系统中高水平表达，表达量超过30％，其中绝大部分形成包涵体，经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性，证明有生物活性；结论：TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用。     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

一种具有抗肿瘤活性的新型尿激酶原Kringle结构域变体蛋白的研究

利用PCR技术获得人尿激酶原Kringle结构域基因,将其克隆至具有T7启动子的表达质粒pET29a中,并进而插入plasminogen Kringle 5一段16肽片段构建了其变体,重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,其产物以包涵体形式存在．通过体外复性,得到可溶性的prourokinase Kringle及其变体．所得蛋白质经过动物肿瘤模型测活,确定变体蛋白具有抑制肿瘤生长作用．     

嗜鞣管囊酵母adh2基因克隆及其原核表达

通过对不同酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的多重同源性分析比对,克隆出嗜鞣管囊酵母P-01(Pachysolen tan-nophilus)乙醇脱氢酶Ⅱ基因的一段长为340 bp的片段(EU570211).利用RACE技术,扩增出嗜鞣管囊酵母P-01adh2基因的全长ORF(1 056 bp).将基因与pMD18-T载体连接,验证后测序.经酶切、酶连到表达载体pET-20b并成功构建了基因的原核表达载体pET-20b-adh2,在E.coliBL21(DE3)中诱导表达出adh2重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,预期大小约为35 kD.     

HIV-1外膜蛋白gp120在酵母Pichia pastoris中的表达

目的 用巴斯德毕赤酵母系统表达HIV外膜糖蛋白gp120.方法 将从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp160的基因序列中扩增出的gp 120分子的长片段基因(1 419 bp)和短片段基因(417bp)分别克隆入真核表达载体pPICZαA与pPICZB中,以电穿孔法转化酵母GS 115.用YPDS-zeo平板筛选重组子、PCR方法检测整合到酵母菌GS 115基因组中的gp 120片段基因,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.结果 诱导后gp 120短片段多肽在GS 115中少量表达,在诱导表达24 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高,表达产物被降解,具有良好的抗原特异性.诱导后gp 120长片段多肽未被GS 115所表达.结论 在巴斯德毕赤酵母中成功表达gp 120分子长片段需要优化gp 120基因,为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础.     

HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达

目的：克隆HLA-A*0207(A2)重链基因，构建在羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的A2重链胞外区原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2^ 供白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序，并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体，在大肠杆菌B121(ED3)中进行表达。结果：从31名HLA-A2^ 供白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示，只有从供2得到的基因是HLA-A*0207。将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合，构建融合蛋白表达载体，并以测序验证。融合蛋白在B121(ED3)中获得高效表达，产物相对分子质量为35000，约占菌体总蛋白的30％，主要存在于包涵体中，对包涵体进行洗涤后得到纯度为80％的重组蛋白。结论：成功克隆HLA-A*0207基因，构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达。     

D-海因酶基因重组子的构建和酶的表达活性

以中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)SS—ori总DNA为模板，用PCR法扩增D-海因酶基因，分别克隆到5种不同的载体，并转入5种不同的Escherichia coli菌株，获得25株工程菌，进行培养与诱导表达．细胞经超声处理后，通过SDS—PAGE和酶活性两种指标比较表达产物．结果表明，除3株工程菌具有D-海因酶活性外，其它均为无酶活性的不溶性包涵体，包涵体经变性、复性后，可部分获得有活性的D-海因酶，其比活为0．90U／mg，复性率约为20％．此外，对包涵体产生的原因及可能解决办法也进行了讨论．     

卡介苗中具启动子活性片段克隆及分析

利用启动子探针型质粒ｐＫＫ２３２－８从卡介苗染色体ＤＡＮ的ＢａｍＨＩ酶切片段中克隆到４个具启动功能的ＤＮＡ片段,测定各重组子对氯霉素（Ｃｍ）的抗性,其中含３．３Ｋｂ外源片段的重组质粒ｐＢＣＧ２大肠杆菌转化子在ＬＭ培养基上对Ｃｍ抗性可达１７０×１０－６ｇ／ｍＬ,作了该片段的限制性酶切图谱．对ｐＢＣＧ２利用ＳａｌⅠ位点,亚克隆出４种部分重叠的具启动功能的ＤＮＡ片段,这４种重组质粒分别命名为ｐＢＣＧ２－１,ｐＢＣＧ２－２,ｐＢＣＧ２－６和ｐＢＣＧ２－８,并分析了其中插入片段的大小及其转化子对Ｃｍ的抗性．将ｐＢＣＧ２－２的ＳａｌⅠ外源片段插入到分枝杆菌启动子探针型穿梭质粒ｐＥＱ３,获得一个可在卡介苗中表达ｌａｃＺ基因的重组子ｐＥＢ２２．斑点杂交实验证明,具有启动功能的ＤＮＡ片段来源于卡介苗的染色体ＤＮＡ．结果表明克隆到一个对大肠杆菌和卡介苗均具启动子活性的ＤＮＡ片段     

白喉毒素突变体CRM197原核表达载体构建及其蛋白表达

将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pBAD-DEST49中,转化到大肠杆菌菌株（ATCCMC1061）．经阿拉伯糖诱导,CRM197获得高效表达．目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后经DEAE阴离子交换后获得高于95％纯度的CRM197样品．用该样品做Westernblotting鉴定后,能得到单一的特异性条带．本实验的表达策略,为CRM197进一步生产及应用奠定基础．     

瑞氏木霉内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl1的分子改造

为了提高瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶活力,用分子改造的方法改造其内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl 1.用DNase I消化EglL 1,回收50～200bp的片段,用T4 DNA连接酶连接回收的片段,进行PCR反应,将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,用比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力...     

Effect of 5'-deletion of Arabi-dopsis profilin2 promoter on its vascular specific expression

Based on the published sequence of profilin2 promoter of Arabidopsis thaliana, a full-length promoter (1667 bp) was amplified by PCR. The 5' -end deletion fragments with length of 1380, 1153, 969 and 597 bp were then fused with gus (uidA.) gene respectively. Constructed plant expression vectors were individually transferred into Kalan-choe laciniata and transgenic plants regenerated. GUS his-tochemical assay confirmed that the full-length promoter Pfn1.7 was vascular-specific. Deletion assays showed that profilin2 promoter could be divided into three parts. Deletion of fragment 1 ( -1667--1380 bp) resulted in constitutive expression, suggesting that element(s) responsible for vascular-specific expression might exist in this region. Fragment 2 located at -1153 - -597 bp strongly inhibited gus gene expression. Fragment 3 ( -597 - -1 bp) is considered as a basic domain of profilin2.     

Promoter activities of genes cpcT2 and cpcS2 in Nostoc PCC 7120

To study the promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2,several upstream DNA fragments of these two genes with different lengths were selected.These fragments were fused with promoterless gfp(reporter gene) for constructing five recombinant plasmids.Then,these recombinant plasmids were transferred into Nostoc PCC 7120 by conjugation.The promoter activities of genes cpcT 2 and cpcS 2 were determined by observing the fluorescence of green fluorescent protein(GFP) with a fluorescence microscope.The result showed that the 1 300 bp(-1 300 to 0 bp) and 2 600 bp(-2 600 to 0 bp) upstream fragments of cpcT 2 had strong promoter activity and the promoter activity of the 680 bp(-680 to 0 bp) fragment was weaker than that of two above fragments of cpcT 2.The 2 000 bp(-2 000 to 0 bp) upstream fragment of cpcS 2 revealed weak promoter activity.This showed that a strong promoter of cpcT 2 was located in the upstream fragment between-680 and-1 300 bp.     

Dissection of SARS Coronavirus Spike Protein into Discrete Folded Fragments

Introduction Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), which is the causative agent of the atypical pneumonia, was first identified in the fall of 2002 to be a previously unknown member of the family of coronaviruses[1]. The rapid transmis…     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序．测序结果在Gen—Bank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的．这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础。     

杨树毒蛾核型多角体病毒的形态结构与病毒DNA的限制性内切酶酶谱分析

杨毒蛾核型多角体病毒(Lencoma Salicis nuclear polyhedrosis virus,简称LsNPV)是一种多粒包理型的杆状病毒。在扫描电镜下呈不规则多面体,病毒多角体大小不一致,平均直径为1.2μm。病毒粒子长为215nm直径30～50nm。LsNPV的基因组是一个环状双链DNA。限制性内切酶BglI,SalI分别把病毒DNA酶解为26和24个限制性片段,由片段总和法计算,基因组大小为86.3kb。     

Reconstitution by MHC-restricted peptides of HLA-A2 heavy chain with beta 2-microglobulin, in vitro

Cytotoxic T lymphocytes kill virally infected cells when they detect antigenic fragments presented by class I major histocompatibility complex (MHC) antigens (HLA in humans). The crystal structures of HLA-A2 and HLA-Aw68 reveal that peptide-antigen forms an integral part of the HLA structure, being retained in a prominent groove even after purification and crystallization. Here we report that the heavy chain and beta 2-microglobulin of HLA-A2, after separation and fractionation in denaturants, reassemble efficiently under renaturing conditions only in the presence of MHC-restricted peptides. A complex of heavy chain, beta 2-microglobulin, and viral peptide in the ratio 1:1:1 is formed in up to 46% yield. Reconstitution is not stimulated by either of two peptides not restricted to HLA-A2. The reconstituted complex of HLA-A2 and the influenza virus (B/Lee/40) nucleoprotein peptide, Np (85-94), crystallizes under conditions previously used to crystallize HLA-A2. Peptide-linked folding and assembly suggests mechanisms for the unusual capacity of HLA to bind many peptides of diverse sequence.     

一种简便有效的PCR扩增片段直接回收克隆方法

作者提供一种简便快速的克隆方法，即直接对琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物进行克隆，可获得较高的阳性克隆率.结果显示，300～700 bp大小的片段阳性克隆率为70.72%，300 bp以下和大于700 bp的片段阳性克隆率分别达到60.38%和45.33%.该方法适用于含有大量不同大小DNA片段的PCR产物并需要同时对其进行回收和克隆的样品，不仅可以大大简化实验过程，也可以降低假阳性出现的机会.