一种简便有效的PCR扩增片段直接回收克隆方法

作者提供一种简便快速的克隆方法，即直接对琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物进行克隆，可获得较高的阳性克隆率.结果显示，300～700 bp大小的片段阳性克隆率为70.72%，300 bp以下和大于700 bp的片段阳性克隆率分别达到60.38%和45.33%.该方法适用于含有大量不同大小DNA片段的PCR产物并需要同时对其进行回收和克隆的样品，不仅可以大大简化实验过程，也可以降低假阳性出现的机会.     

辛伐他汀对C2C12细胞中utrophin基因表达的影响

本文采用MTT法,观察不同浓度辛伐他汀(0,1,3,10,30 and 100μmol/L)对C2C12细胞活力的影响,并通过定量RT-PCR方法对utrophin和TNF-α基因的mRNA的表达进行了研究.随着辛伐他汀浓度和作用时间的增加,C2C12细胞的活力在降低;不同浓度辛伐他汀对utrophin和TNF-α的mRNA表达具有影响作用,为阐明辛伐他汀的肌毒性作用机理提供了新的思路.     

辛伐他汀对高胆固醇血症小鼠肝脏基因表达的影响

采用抑制消减杂交方法结合targeted display法分离鉴定辛伐他汀处理高胆固醇血症小鼠后差异表达的基因,并采用定量RTPCR方法对utrophin、TNF-α的mRNA转录水平进行了研究.结果表明辛伐他汀处理后7个基因上调表达,19个基因下调表达;这些基因涉及转录、脂质代谢、免疫反应等过程.定量RT-PCR分析显示utrophin与TNF-α的mRNA转录水平降低.     

辛伐他汀治疗高胆固醇血症小鼠过程中肝脏的差异表达基因

为了研究辛伐他汀治疗高胆固醇血症过程中肝脏的差异表达基因,我们利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了高胆固醇血症小鼠及高胆固醇血症经辛伐他汀治疗小鼠的肝脏双向差异表达基因文库,并采用改进的negative subtraction chain(NSC)方法去除正向文库的绝大部分假阳性背景,使得SSH文库的容量缩小了近50倍,对筛选到14个差异表达克隆再经过斑点杂交验证,最终获得8个阳性克隆.经DNA序列测定和基因功能分析,结果表明,辛伐他汀治疗高胆固醇血症过程中,小鼠肝脏差异表达的已知功能基因主要有以下几类:脂类代谢基因、炎性免疫反应相关基因、细胞粘附基因、逆境胁迫基因.改进的NSC和SSH技术的结合使用,大大地增加了差异表达基因文库的阳性率,提高了获得差异表达基因的效率.