芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质

芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、Sephaery1 S200柱层析、CMSephrose FF柱层析,得到纯化的脂肪酶,纯化倍数为9.45倍,活性回收率为4.27%.对该酶性质研究表明:该酶水解橄榄油的最适温度为50℃,最适pH为8.0,在60℃以下和pH4~10之间有很好的稳定性.K+,Mg2+对该脂肪酶的水解活性有促进作用,而Na+,Mn2+,Ca2+对脂肪酶则没有显著的促进作用,Fe2+对酶活的抑制作用不明显.浓度为0.1%时,Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用;Brij 35,Tween-80对酶活力的影响不明显;离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用.     

温度和pH对驼背鲈消化酶活力的影响

采用酶学分析方法研究了温度和pH对驼背鲈3种主要消化酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)活力的影响。结果表明:在设定的温度和pH范围内,驼背鲈消化酶活力均随着温度和pH的升高呈先升后降的趋势。其中,胃蛋白酶的最适温度为40~45℃,肠、幽门盲囊、肝蛋白酶的最适温度均为40℃;胃脂肪酶的最适温度为35℃,幽门盲囊的最适温度为40~45℃,其他部位均为40℃;胃淀粉酶的最适温度为40℃,其他部位均为35℃。胃蛋白酶的最适pH为3.2,肠、幽门盲囊、肝的最适pH均为8.2;胃、肝脂肪酶的最适pH分别为7.2、8.2,其他部位均为6.2;胃淀粉酶的最适pH为7.2~8.2,其他器官的最适pH均为7.2。各部位在最适温度和pH下,脂肪酶酶活力顺序为肠胃肝幽门盲囊,淀粉酶酶活力顺序为肠幽门盲囊胃肝;蛋白酶在最适温度和pH下的酶活力顺序分别为肠胃肝幽门盲囊、肠胃幽门盲囊肝。     

蝾螺(Turbo cornutus Solander)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

以蝾螺内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG 200分子筛柱层析和两次DEAE SephadexA 50离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯的N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶酶制剂.纯酶的比活力为1448U·mg-1.酶的紫外特征吸收峰在275nm处,内源荧光发射峰在340nm处.以对 硝基苯 N 乙酰 β D 氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明:酶的最适pH为4.5,最适温度为45℃.该酶在pH3.5～6.0区域较稳定,而在pH>7能很快失活;在40℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于40℃,酶稳定性较差,很快失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.13mmol·L-1,最大反应速度Vm为17.68μmol·L-1·min-1.     

pH和温度对黄姑鱼主要消化酶活力的影响

采用酶学分析的方法,研究了在不同pH和温度下离体黄姑鱼蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性变化。结果表明:pH和温度对黄姑鱼主要消化道各部位消化酶活力多数有显著影响(P0.05),在黄姑鱼前肠、中肠、后肠、胃、肝胰脏5个部位,蛋白酶的最适pH分别为6.4、7.8、7.8、2.2、6.4,淀粉酶最适pH分别为5.0、7.8、7.8、6.4、5.0,脂肪酶的最适pH分别为5.0、6.4、7.8、3.6、5.0;在最适pH条件下,前肠、中肠、后肠、胃、肝胰脏中蛋白酶的最适温度均为40℃左右,淀粉酶的最适温度除肝胰脏中为40℃外,其他部位均为30℃,脂肪酶的最适温度均为40℃。蛋白酶活力在pH 6.4、37℃时达到最大值1 606.576±83.457 U,淀粉酶活性在pH 6.4、37℃时达到最大值188.086±17.538 U,脂肪酶在pH 5.0、40℃时达到最大值34.247±1.926 U。     

温度和pH对黑鲷主要消化酶活性的影响

本试验研究了温度和pH值对黑鲷胃、肠及肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等3种主要消化酶活性的影响.结果表明:黑鲷蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适温度分别为50℃,40℃和30℃;在胃,蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的最适pH值分别为2.0,5.0和4.0,均在酸性范围;而在肠和肝胰脏,蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的最适pH值分别是7.0,7.0,7.5和7.5,7.0,7.0,且均为中性或弱碱性.并且在适宜的温度和pH值条件下,黑鲷不同组织蛋白酶活性大小顺序为:胃>肠>肝胰脏;淀粉酶活性大小顺序为:肝胰脏>肠>胃;脂肪酶活性大小顺序为:肠>肝胰脏>胃.     

pH和温度对黑斑蛙消化道脂肪酶活力的影响

采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法,对黑斑蛙(Rana nigromaculata)消化道不同部位脂肪酶活力进行了测定并考察了pH和温度对脂肪酶活力的影响.结果表明,黑斑蛙消化道不同部位脂肪酶活力由高到低依次是中肠、后肠、前肠、胃和食道.pH和温度对脂肪酶活力的影响较大,二者与脂肪酶活力的关系曲线均呈单峰型,胃和肠道脂肪酶的最适pH值分别为5.0和7.5,最适温度均为40℃.此外对蛙类的人工养殖提出了几点建议.     

兰州鲇消化器官理化特征及pH值对其消化酶活力的影响

对兰州鲇(Silurus lanzhouensisChen)消化器官的理化特征及在不同pH条件下的消化酶活力进行了研究.结果表明,兰州鲇比肠长、比胃重、比肠重、比肝胰脏重、比内脏重分别为0.91±0.25、0.0158±0.0045、0.0112±0.0054、0.0199±0.0069和0.0916±0.0293;胃、前肠、中肠、后肠壁及胆汁的pH值分别为5.5~6.5、5.5~7.0、6.0~7.0、6.0~7.0和5.5~7.0;胃、肝胰脏和肠淀粉酶最适pH值分别为5.4、6.6和7.0,脂肪酶最适pH值分别为5.4(或5.8)、6.6和6.6.兰州鲇胃和肠的pH值环境均有利于淀粉酶和脂肪酶活力的发挥.在最适pH条件下,肝胰脏淀粉酶活力略高于肠,胃淀粉酶活力最低,而肝胰脏和肠的脂肪酶活力相同,胃脂肪酶活力最高.从消化器官特点和消化道内食物组成可以看出,兰州鲇消化生理特性与其肉食性特点相适应.     

脂肪酶产生菌的筛选及基因的克隆表达

目的筛选出脂肪酶活性较高菌株,通过脂肪酶基因克隆技术获得高表达的脂肪酶,根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.方法采用透明圈法,以三丁酸甘油酯为底物筛选脂肪酶活性较高菌株;通过PCR扩增获得其脂肪酶基因Pseudomonas peli(PP)序列,构建pET-28 a表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达;通过Ni柱将脂肪酶纯化,并根据酶活曲线确定该酶的最适温度和最适pH.结果筛选到一株脂肪酶活性较高的菌株,16S rRNA基因序列比对结果初步鉴定为Pseudomonas peli.PCR扩增得到的基因片段长度为801 bp,其序列与Pseudomonas peli中的脂肪酶基因序列相似性达到100%,PP基因在大肠杆菌中异源表达蛋白的分子量约29 KD,该蛋白在55℃、pH 7.0时活性最高.结论通过基因克隆表达后得到的脂肪酶Ni柱纯化后纯度达95%以上,且耐高温,为脂肪酶工业化应用奠定了基础.     

硅 藻 土 固 定 化 脂 肪 酶

采用硅藻土作为载体, 对脂肪酶进行固定化, 研究了固定化条件对固定化脂肪酶 的催化活性以及硅藻土吸附脂肪酶量的影响. 得到最适的固定化反应条件： 温度为30~35 ℃; pH值为7.7; 缓冲液离子浓度在0.01~0.03 mol/L之间; 载体与脂肪酶的质量比为 8∶1.     

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-(-)-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-(-)-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km(NADH)=99.2μmol/L和Km(苯乙酮酸)=263.3μmol/L.     

包衣酶在油/水两相体系中催化水解橄榄油反应

用合成的谷氨酸十二烷基酯核糖醇对来源于Candidarugosa的脂肪酶包衣后在油/水两相体系中水解橄榄油为反应模型.确定了最佳水油比范围为1～3,最适pH值为7.0左右,温度为30℃,油相有机溶剂为异辛烷.包衣酶的最大活性达到48.8mmol·min-1·g-1蛋白质,是天然酶活性的1.8倍.对底物选择性研究表明:包衣酶和天然酶的最适底物均为橄榄油,酰基链越长,酶活越高.包衣酶的米氏常数只有天然酶的一半,最大反应速度是天然酶的1.4倍.     

烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

从烟曲霉Aspergillus fumigatus GIM3.20中克隆获得了一种脂肪酶B基因(AFLB)。通过序列比对,发现AFLB与南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列有31%的一致性,两者同属CALB家族脂肪酶；AFLB 含有与家族其他成员类似的保守五肽序列(SWSQG),预测AFLB的催化三联体分别为S233、D318和H361,其中Ser233位于保守五肽序列中；此外AFLB含有一段N-端延长序列(由第1~128位氨基酸组成),是曲霉属脂肪B的特有序列。在毕赤酵母中成功地异源表达了脂肪酶AFLB,并通过亲和层析进行了纯化。SDS电泳结果显示,该酶存在部分高度N-糖基化和部分无糖基化的两种形态,对应分子量分别为45~66kDa和42kDa。酶学性质表征结果显示,重组脂肪酶AFLB最适反应pH 值为7.0,最适反应温度为40℃,并在50℃以下具有较好稳定性,其最适底物为肉豆蔻酸对硝基苯酯。脂肪酶AFLB与CALB有高度亲缘性,具有潜在的工业应用前景。     

新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质

【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB,构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达,再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达,发酵液上清酶活力达到78U/mL,粗酶液经纯化后比活力为258U/mg。重组酶PulB最适反应温度和pH值分别为55℃和5.0,在较窄的酸性范围内(pH值4.5~5.5)酶活力比较稳定;对普鲁兰糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL,Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列与GenBank数据库里的任何序列都没有同源性,在蛋白质序列上,由基因pulB编码的氨基酸序列与T.aegyptius的环麦芽糖糊精酶相似性最高,BlastX比对的Identities为54%,Positives为69%,SMART结构预测分析发现,pulB具有淀粉酶的结构域。底物特异性分析表明,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。【结论】重组酶PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉,属Ⅰ型普鲁兰酶。     

醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶的研究

以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体对脂肪酶进行吸附固定,研究了不同条件对固定化脂肪酶活性的影响,得到了最佳固定化条件:酶浓度0.020 g/mL,温度20℃,pH8.0,振荡速度100 r/min,吸附时间2 h,膜酶活力最高为4.5 U/cm2;膜酶转化反应最佳条件:最适温度35℃,比游离酶降低了5℃;最适pH 8.5,与游离酶相比pH向碱性偏移,固定化脂肪酶间歇水解橄榄油132 h酶活力为原酶活力的56.7%.     

粘质沙雷氏菌低温脂肪酶的基因克隆与酶学性质分析

克隆一个源于北极冻土沙雷氏菌的脂肪酶基因lip18,实现其在大肠杆菌中的表达,并进行酶学性质研究.克隆脂肪酶基因lip18,并构建p ET-28a(+)-lip18重组表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导优化重组蛋白表达,并研究其酶学性质.克隆得到脂肪酶基因lip18,全长为1 842 bp,编码614个氨基酸.重组菌的诱导温度对蛋白表达影响很大,在最适诱导温度为20℃时脂肪酶大量表达,重组脂肪酶的相对分子质量约为65 ku.酶学性质研究表明:重组酶高效水解C10~C16的中、长链脂肪酸,最适作用温度30℃,最适作用pH值7.0,并且在0℃条件下有一定的催化活性,热稳定性差,是低温中性脂肪酶;同时,对有机溶剂有较好的耐受性.     

广谱降解有机磷农药的真菌酶解研究

从农药污染土壤中分离出的一株真菌具有广谱降解有机磷农药的能力.菌体培养物经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephrose CL6B柱层析纯化广谱有机磷农药水解酶.研究结果表明该酶为胞内酶,主要定位在细胞膜上.酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.5,在50℃以下以及在pH6～9.5范围内活性稳定.Hg2 、Fe3 、对氯高汞苯甲酸、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用,而Cu2 、巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷光甘肽和去污剂对酶有不同程度的激活作用.该酶不仅可以作用于含P-O键的有机磷农药;而且也能水解含P-S键的有机磷农药.以甲基对硫磷和内吸磷为底物的Km值分别为63μmol/L,256μmol/L;Vmax分别为306μmol·min-1,189 μmol·min-1;Kcat分别为1 102 s-1,610 s-1.     

风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白工艺优化研究

通过风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白,以蛋白水解率为指标,采用单因素实验探究水解pH、水解温度、料液比、酶浓度、水解时间五个因素对牦牛血液蛋白水解效果的影响.在此基础上以五因素三水平正交试验(L_(18)(3~7))优化水解工艺,发现较佳水解工艺参数为A_1B_2C_3D_3E_3,即最适pH为6.0、最适温度为50℃、料液比为1:9.0 g·mL~(-1)、酶浓度1.25%、水解时间6 h,此时蛋白水解率为33.42±0.44%,水解液氨基酸总量是牦牛原血氨基酸总量的174倍.本实验为牦牛屠宰场血液废弃物资源利用提供理论基础,从而提高牦牛的综合使用价值.     

Klebsiella sp.GXK-1的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

【目的】克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiellasp.GXK-1菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质。【方法】比对分析GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因的保守区。扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白RHA1的酶学性质。【结果】以pNPR为底物,进行重组酶酶学性质的研究。重组酶RHA1的最适pH值和最适温度分别为5.0和45℃,Km值为(0.223±0.030)mmol/L,V_(max)值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg)。在pH值为6~10的缓冲液内酶活力仍保持在80%以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降。RHA1能水解pNPR、橙皮苷和芦丁。【结论】RHA1具有良好的pH稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值。     

偏甘油酯脂肪酶PrLip的重组表达及酶学性质表征

偏甘油酯脂肪酶因其独特的底物偏好性具有广阔的应用前景。研究从食品安全菌娄地青霉的基因组中发现了一个假定的偏甘油酯脂肪酶prlip基因,通过全基因合成技术获得该酶基因序列,并构建了PrLip组成型表达的毕赤酵母基因工程菌。工程菌在30℃发酵培养60h,发酵活力达到22.26U/mL。利用阴离子交换层析法纯化,获得纯度大于90%的脂肪酶PrLip。酶学性质研究发现该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为7.0,40℃的半衰期为6h,水解及酯化反应证实PrLip是一种偏甘油酯脂肪酶。脂肪酶PrLip具有良好的温度耐受性及对大多数表面活性剂的耐受性,使其具有广阔的工业应用前景。     

朊圆酵母尿酸酶的基本特性研究

研究了尿酸酶分离纯化条件和pH、温度、底物浓度、一些有机和无机试剂对尿酸酶酶促反应速度的影响.研究结果表明,用Triton X-100及巯基乙醇处理细胞悬液(pH 8.5),再用超声波处理破碎细胞效果最佳.硫酸铵沉淀尿酸酶的最佳浓度为75%.用Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析和Xanthine-agarose亲和层析两步纯化步骤可获得理想纯度的酶制剂.在一定的条件下,尿酸酶的最适pH和酸碱稳定pH范围分别为8.5和5.0~12.最适温度为37℃;热稳定性较好,在50℃处理30 min时