内含肽介导的鼠多瘤病毒样颗粒生产表达和纯化

鼠多瘤病毒样颗粒(VLPs)可由结构蛋白VP1自组装而成,可用于疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物材料等方面.针对目前VP1生产中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,生产成本较高、操作复杂的问题,利用内含肽(intein)自剪切的特征,将内含肽插入到VP1与GST标签之间进行融合表达,表达产物经亲和色谱纯化,并通过改变柱内pH值、温度诱导内含肽剪切,使VP1与GST-intein分离从而获得VP1蛋白,产量为4,mg/(L培养基).纯化的VP1可自组装成与天然鼠多瘤病毒样颗粒一致的VLPs.结果表明,内含肽介导鼠多瘤病毒样颗粒生产纯化流程简单易行,且无需凝血酶参与,大幅降低成本,为VLPs的高效制备奠定了基础.     

一种新的分子内可自剪切多肽介导的可视化原核蛋白质表达系统

通过在目标蛋白和荧光蛋白等标签蛋白之间引入可引起分子内剪切的多肽是监测蛋白质表达的重要方法.通过将小鼠MYRF的介导其分子内自剪切的ICA结构域插入到目标蛋白和指示蛋白mCherry之间,既实现了对融合蛋白表达的直接观察,同时实现了融合蛋白的高效自剪切,并释放出游离的目标蛋白.实验证明,该可视化蛋白质表达系统可在原核细胞中有效的表达不携带标签序列的目标蛋白.     

新型内含肽介导PHB系统表达纯化PoIFN-α的研究

为简化猪α干扰素蛋白（PoIFNα）的纯化步骤,以蛋白质自切割元件内含肽（Intein）替代蛋白酶,并以细菌自身产生的聚β-羟基丁酸酯（PHB）颗粒替代亲和配基,构建了新型内含肽介导PHB纯化PoIFNα的体系.结果显示,构建的基因工程大肠杆菌系统可成功实现PoIFNα的表达和纯化;φ（乳酸钠）=2.7%时,比较适宜工程菌的PHB累积;当诱导自切割反应温度为20℃,pH=6.5,反应时间为24~36 h时,可以实现内含肽C端高效自切割,纯化出的PoIFNα产量为20~30 mg/L.实验为重组猪α干扰素的工业化规模生产奠定了基础.     

中段密码子序列对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响

通过调整表达翻译肽链中段Asp—Pro—Pro三个氨基酸的密码子的序列,观察其对目的蛋白在大肠杆菌中表达的影响。用PCR方法分别在rhBMP4-m基因的5’端加上编码Asp-Pro—Pro酸水解肽的不同简并码序列,克隆入原核融合表达载体pRSET中进行诱导表达,SDS—PAGE分析,观察融合蛋白的表达效果。成功构建9个不同简并码序列的融合表达载体;经诱导表达分析,只有在两个脯氨酸的密码子均为CCG时,融合蛋白才能正常表达,说明改变表达肽链中段氨基酸密码子的碱基序列可以影响融合蛋白的表达效果。     

融合聚精氨酸九肽的小热休克蛋白 原核表达及蛋白纯化

目的构建小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,表达纯化融合蛋白.方法在小热休克蛋白表达载体的基础上利用点突变方法引入聚精氨酸九肽对应序列,转入BL21大肠杆菌感受态细胞进行原核表达,利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化.结果成功构建了融合聚精氨酸九肽的HSP16. 5融合蛋白表达载体,并对其在大肠杆菌细胞中的原核表达进行条件优化,研究显示:在诱导剂IPTG浓度为0. 5 mmol、37℃条件下诱导4 h目的蛋白产量较高.结论此实验成功构建了小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白的原核表达载体,得到了高纯度的小热休克蛋白-聚精氨酸九肽融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础.     

人源抗菌肽LL-37原核表达载体的构建及表达

为了使人源抗菌肽LL-37在原核表达载体中获得高效表达,在不改变LL-37氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏爱密码子表,替换LL-37部分密码子,设计一段新的LL-37序列.采用DNA Work设计4条互补引物,利用SOE-PCR技术扩增完整的LL-37目的片段,以pET-PPPI为载体,构建原核表达载体pET-PPPIL,并制备表达菌BL21(DE3)(pET-PPPIL),该菌经诱导高效表达LL-37融合蛋白,为后续纯化LL-37奠定了基础.     

人膜蛋白CD81的原核表达与纯化

以高效原核表达载体pCold TF为载体骨架,应用PCR、限制性酶切、连接等分子生物学方法,将pCold TF中的六聚组氨酸(His-Tag)序列替换为限制性酶切位点SpeⅠ序列ACTAGT,构建不含His-Tag序列的新载体pL118.以此载体表达蛋白时,通过PCR引物在目的基因3′端添加His-Tag以利于融合蛋白的纯化以及融合蛋白中的Trigger Fac-tor(TF)助溶蛋白的去除.应用pL118对人膜蛋白CD81进行原核表达与纯化,并使用Fac-tor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白,获得3′端含有His-Tag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表达纯化,为CD81靶向药物筛选、抗体制备及深入研究CD81的功能奠定了基础.pL118载体的构建以及CD81蛋白的表达纯化为表达困难的基因实现原核表达提供了一种新的思路和方法.     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD-HA-His的构建及功能检测

为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD,同时为能够与转染的其他生肌因子的表达量进行比较,将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1(+)-HA-His。测序表明克隆的MyoD序列正确,并与标签序列构成一个开放阅读框;Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC,可使融合蛋白能够以较高水平表达;生肌转化实验表明,融合蛋白MyoD-HA能够有效激活靶基因的表达。     

Tat短肽跨膜递送作用的研究(I)——模型蛋白Tat-GFP在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨Tat短肽的跨膜递送作用,利用DNA重组技术在毕赤酵母表达系统中表达融合蛋白Tat-GFP,通过硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶色谱和POROS-20HQ离子交换色谱分离纯化该融合蛋白.表达和纯化了分子量约为29kD的融合蛋白Tat-GFP,在经融合蛋白作用的细胞内检测到融合蛋白的存在.这个结果可望为外源性蛋白进行细胞内治疗提供一种新的工具.     

Tat短肽跨膜递送作用的研究(Ⅰ)--模型蛋白Tat-GFP在毕赤酵母中的表达与纯化

为探讨Tat短肽的跨膜递送作用,利用DNA重组技术在毕赤酵母表达系统中表达融合蛋白Tat-GFP,通过硫酸铵沉淀、SephadexG-75凝胶色谱和POROS-20HQ离子交换色谱分离纯化该融合蛋白.表达和纯化了分子量约为29kD的融合蛋白Tat-GFP,在经融合蛋白作用的细胞内检测到融合蛋白的存在.这个结果可望为外源性蛋白进行细胞内治疗提供一种新的工具.     

线粒体定位序列介导的绿色荧光蛋白基因在烟草中表达的分析

由于绿色荧光蛋白可在活组织或细胞中直接检出 ,因而近年已在转基因植物的研究中用作报告基因 ,这样可在植物生长的任何阶段进行活体筛选和鉴定。本研究利用线粒体定位序列对改良 gfp基因在转基因烟草中的表达进行了观察 ,结果表明 :将GFP直接在细胞质中大量表达会对植物细胞产生毒性 ,从而影响植物细胞的分化 ,而将其定位在线粒体中 ,则从转化细胞产生植株的频率明显增高。     

水稻白叶枯病菌luxR同源基因的克隆和表达

luxR基因是革兰氏阴性菌感应反应（Quorum Sensing,QS）LuxR／Luxl环路中起重要作用的基因．从水稻白叶枯病菌中分离到一个luxR同源基因,命名为xooR．xooR全长765bp,编码一个由254个氨基酸残基组成的转录因子,分子质量和等电点分别为28．3ku和8．72．XooR蛋白的N一端15AA-171AA是一个Autoindbind结构域,C-端191AA-245AA是一个HTH（helix-turn-helix）结合DNA结构域利用原核表达载体pET-24a（＋）和gfp基因构建融合蛋白表达系统,Western blot分析表明XooR-GFP融合蛋白大小为54ku,xooR基因成功地在E．coliB1．21中实现了表达．     

含内蛋白子融合表达载体的构建与人神经营养因子-3的初步表达

为了构建一个含蛋白质剪接元件的表达载体 ,将 3.38kb的 p Ex Sec 的多克隆位点 (Eco R /Bam H )处插入一个含多个酶切位点的 49bp寡聚核苷酸。然后将 p MYB12 9中 intein- CBD基因片段移插入上述经改造的p Ex Sec I中 ,构建成含内蛋白子的表达载体 p Ex IC。根据人神经营养因子 - 3(h NT- 3)的已知 DNA序列 ,设计含 NdeI/Xho I酶切位点的引物 ,用 PCR法从人全血总 DNA中扩增 h NT- 3,再插入 p Ex IC载体中 ,构建成 p Ex IC- h NT- 3重组质粒。经转化后 ,工程菌 E.coli BL 2 1(DE3) /p Ex IC- h NT- 3在 L B培养基中获得融合表达 ,根据 intein的自剪切原理 ,在还原剂 DTT作用下 ,初步获得了约 14k D的 h NT- 3目的蛋白。     

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因（gfp）的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过Rco R I和Pxt I双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。     

Two virus-encoded RNA silencing suppressors, P14 of Beet necrotic yellow vein virus and S6 of Rice black streak dwarf virus

Functional analysis for gene silencing suppressor of P14 gene of Beet necrotic yellow vein virus and S6 gene of Rice black streak dwarf virus was carried out by agro- infiltration with recombinant vectors of Potato virus X. The phenotype observation of green fluorescent protein (GFP)expression and Northern blot showed that the gene silencing of gfp transgenic Nicotiana benthamiana induced by homologous sequence was strongly suppressed by the immixture infiltration of either the P14 or the $6. In the suppressed plants, the gfp mRNA accumulation was higher than that in the non-suppressed controls and the symptoms caused by PVX infection became more severe, especially the gfp DNA methylation of plant genome was significantly inhabited when co-infiltrated with RBSDV S6 gene. These results suggested that these two virus genes were potentially to encode for proteins as RNA silencing suppressors.     

Expression ofChlamydomonas actin-gfp fusion gene in tobacco suspension cell and polymerization of the actin-gfp proteinin vitro

The fusion gene of actin (cDNA ofChlamydomonas reinhardtii) and green fluorescence protein (gfp) had been constructed into two expression vectors which could be expressed inE. coli and tobacco suspension cells BY2. The correct expression was observed inE. coli and BY2 with a fluorescence microscopy. The fusion protein, which took part in the membrane skeleton, was mainly located peripherally along the membrane, specially the fusion protein was distributed around nucleus and cell plate, while the fusion protein also forms F-actin in the cell. The fusion protein was purified from Bl21plus by ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The purified production could polymerize into F-actin when the actin polymerizing buffer was added. It was demonstrated that the characteristics and function of actin inChlamydomonas was similar with those of animals and higher plants.     

PTD-Tat之C端融合在活体体内的跨膜递送作用

报道了Tat蛋白转导区域(PTD-Tat)的C端融合蛋白在线虫和小鼠体内的跨膜递送作用.将重组表达质粒pGEX-GFP-Tat在大肠杆菌中高效表达出的融合蛋白GST-GFP-Tat对小鼠腹腔注射(ip)17h后,荧光显微镜观察其心、肝和肾组织,均检测到强烈的绿色荧光,甚至该蛋白跨越了血脑屏障(BBB).此外用融合蛋白喂食线虫发现蛋白分布于线虫消化管道及其原体腔,且表现出的跨膜递送活性与喂食时间和蛋白浓度呈现正相关.该研究结果拓宽了PTD-Tat在蛋白药物递送方面的应用范围,为蛋白质疗法开辟了新的视野,并为其有效应用提供理论指导.     

绿色荧光蛋白基因转化内生解淀粉芽孢杆菌的研究

通过重叠延申法将枯草芽孢杆菌的启动子PSJ2与绿色荧光蛋白基因(gfp)的ORF连接起来,构建绿色荧光蛋白表达盒,再通过RcoR I和PstI双酶切将表达盒连接到pUS186载体上,转化解淀粉芽孢杆菌TB2菌株,得到可发出绿色荧光工程菌,工程菌对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用与野生菌株相当。     

Construction of Yeast Vectors with Resistance to Geneticin

IntroductionYeast Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) hasbeen widely used in molecular biology as well asinthe industrial production.Its genetic backgroundhas been well studied and a series of cloning andexpression vectors have been constructed for DNAtransformation into yeast[1 ] .The selection markersof these conventional vectors are usually H IS3 ,TRP1 ,LEU2 ,and URA3 [1 ,2 ] . These selectionmarkers are responsible for the biosynthesis ofsome amino acids and consequently the hos…