中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

枯草芽孢杆菌突变株BS—9发酵D—核糖条件研究

以枯草芽孢杆菌为出发菌株,经紫外线诱变处理,选育出莽草酸营养缺陷型突变株ＢＳ－９,其发酵产物经物理、化学鉴定为Ｄ－核糖．通过利用碳源、氮源实验,发现该突变株在以葡萄糖为碳源、玉米浆和硫酸铵为氮源的发酵培养基中生长良好,在温度为３６℃,ｐＨ值为６．８,转速为２３０ｒ·ｍｉｎ－１中摇床培养７２ｈ,Ｄ－核糖质量浓度可高达６７．６ｇ·Ｌ－１,且葡萄糖基本耗尽     

D—核糖生产菌株—转酮酶缺失突变株芽孢形成特性的研究

对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)转酮酶（EC2.2.1.1)缺失突变株FBL04-215芽孢形成特性进行了研究,发现与野生型相比较,突变株具有芽孢形成能力下降的生理特性,同时对影响芽孢形成的重要因素-Mn^2 进行了研究。     

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率，将不同天然信号肽的N，H和C区进行组合，以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中分泌的天然信号肽，以其中4种天然信号肽（SPyvcE，SPyoqM，SPBglS和SPyobB）的H区替换信号肽SPsacB的H区，构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明，适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1，且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%，较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍，较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法，可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。     

产嗜热性α—淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌的初步探讨

嗜热脂肪芽孢杆菌GR2是由嗜热脂肪芽孢杆菌CU21经诱变处理而获得的突变菌株。GR2菌株具有比出发株CU21高的最高生长温度;嗜热性α-淀粉酶的得率增加;并且不利用葡萄糖为主要碳源的性质。在连续培养中,GR2菌株的嗜热性α-淀粉酶得率随稀释率的增加或随培养温度的下降而增大,嗜热脂肪芽孢杆菌的克隆株GR2(PAT9)与GR2(PATHP9)的嗜热性α-淀粉酶得率比宿主CR2的嗜热性α-淀粉酶的得率高10倍。质粒PATHP9是由质粒PAT9经小型化后得到的。连续培养的结果表明,质粒小型化后,单位菌体的质粒的复制数增加,但基因表达效率下降。     

芽孢杆菌组合对海水养殖水体COD的降解效果

【目的】获得一种降解性能优于单菌株的菌株组合,更好地改善目前工业化密度养殖的水体水质。【方法】从刺参(Stichopus japonicus)养殖池塘分离降解效果良好的单菌株,根据菌株之间的拮抗效应,按照2株菌或3株菌进行组合,研究各组合菌株的降解效果。【结果】2株菌的组合第6天时COD含量的均值为422.57mg/L,标准差为63.85,3株菌的组合第6天时COD含量的均值为365.61mg/L,标准差为67.63,说明3株菌的组合整体降解效果比2株菌的组合好,且更容易获得降解效率高的组合,但并不是所有3株菌的组合降解效果都优于2株菌的组合。【结论】确定最优菌株组合为C14(菌株B2,菌株B6,菌株B11),COD降解率为64.29%。经鉴定,菌株B2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株B6为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),菌株B11为嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus),为今后的实践应用提供参考。     

枯草杆菌JAS株α—淀粉酶的产生与其抗衣霉素的关系

为了研究Bacillus subtilis的产α-淀粉酶性状与其抗衣霉素性状之间的关系,进一步选择在诱变育种时能有效地筛选淀粉酶基因突变株的方法,我们对此作了初步探索.衣霉素敏感型的α-淀粉酶工业生产菌B.subtilis JAS经过紫外线诱变后,选得9株抗衣霉素突变株.通过对它们进行的多次发酵酶活力测定,发现其中3株是α-淀粉酶缺陷型、3株酶活力基本不变或降低,另外3株酶活力明显提高,其中1株酶活力是出发菌株的114%—123%.试验表明B.subtilis α-淀粉酶的产生与其抗衣霉素基因的表达有着密切关系.因此,在对该菌的诱变育种时,可以采用衣霉素为粗筛选择压力.     

一株耐高温α-淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化

作者从四川成都及其周边地区的淀粉厂,米厂,面粉厂等样品采集地的土样和污水当中筛选到16株酶活较高的野生型α-淀粉酶生产菌,其中一株编号为C1的菌株酶活最高,液体发酵酶活达到20 U/mL.这株菌能在高温（50 ℃）下生长良好.在电子显微镜观察,有明显芽孢,生理生化常规鉴定为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）,进一步的16S rDNA分子鉴定确定该菌属于枯草芽孢杆菌,命名为B. subtilis C1. 并对B. subtilis C1的产酶条件进行优化.     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

一株α-淀粉酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化

从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中筛选获得了一株高产α-淀粉酶的菌株,命名为SCUEC8.通过对其形态学观察和生理生化特性,结合16S rDNA序列对比分析,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).探讨了不同碳源、氮源、培养条件等因素对枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株产酶的影响,结果表明：在培养时间为16 h、pH为6.0、培养温度为37℃、碳源为20.0 g·L^-1的麦芽糖、氮源为15.0 g·L^-1的胰蛋白胨、金属离子为1.0 g·L^-1的Mn²⁺时,枯草芽孢杆菌SCUEC8菌株生长量和α-淀粉酶的活性较高.     

地衣芽孢相菌高α—乙酰乳酸脱羧酶活力菌株的筛选

以从土壤中分离出的9株地衣芽孢杆菌为源菌株，通过α-乙酰乳酸脱羧酶活力实验发现BL-4的产酶活性最好，通过UV和NTG对BL-4进行复合诱变，获得了一株产酶活性比出发菌株BL-4高1.22倍的α- 乙酰乳酸脱羧酶高产菌株，并研究了该菌株的最佳发酵产酶条件是培养温度30℃，发酵时间36h，发酵液起始pH6.5。     

在淀粉液态培养基中生产枯草杆菌α-淀粉酶的研究

以枯草杆菌（Bacillus subtilis BF7658）为实验菌株，以淀粉为主要原料，采用液态培养基发酵，生产α-淀粉酶．结果表明：（1）在23℃至44℃内，培养基起始pH值为自然pH，产酶最适培养温度为37℃；（2）枯草杆菌在淀粉液态培养基中37℃，振荡培养，其产酶最适淀粉与水组成比例为：75：100；（3）在最适温度37℃下，淀粉：水为75：100时，最适培养时间为36h．     

抗木材变色高效菌株B26-10的诱变选育

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B26分离自白桦林地土壤,对多种变色菌具有抑制效果。经紫外诱变,筛选得到1株抑菌活性更强的突变菌株B26-10。与菌株B26相比,突变菌株B26-10显著提高了对引起木材变色的绿色木霉7258、甘薯长喙壳8430和交链孢5173的抑菌效果,提高幅度分别为60 ％、46 ％和25 ％。菌株B26-10经传代10次后,抑菌效果稳定。对突变菌株B26-10的上清液、发酵液及高温处理后的发酵液进行抑菌活性测定,结果表明,发酵液的抑菌活性略大于上清液抑菌活性,发酵液经高温处理后无抑菌活性。菌株B26-10的抑菌作用可能与其具有抑菌活性的代谢产物有关,代谢产物可能为蛋白类物质。在白桦木片被变色菌侵染之前,利用菌株B26-10对木片进行生防处理,可以有效地控制白桦变色。     

利用Minitab优化耐高温淀粉酶发酵培养条件

利用Minitab软件中的Plackett-Burman实验设计和响应面分析法,对耐高温α-淀粉酶产生菌Bacillus subtilis C1的发酵培养条件进行优化。在单次单因子法得出的适宜条件基础上,综合考虑所有影响因素,对培养条件进行统计分析,得到Bacillus subtilis C1产耐高温α-淀粉酶的最佳培养条件。研究结果表明:优化培养基的组成(200 mL)为麸皮2.16 g,棉粕粉1.98 g,酵母粉0.40 g,NaCl 1.00 g,CaCl2 0.40 g,淀粉0.10 g。培养基优化后的酶活为2 329 U/mL,约是培养基优化前酶活的12.55倍,酶活得到显著提高。     

华北地区圈养大熊猫粪便中产纤维素酶芽孢杆菌菌株的分离与鉴定

为分离筛选大熊猫肠道中具有纤维素降解能力的芽孢杆菌菌株,首先对8份大熊猫粪便进行高温水浴处理,利用刚果红平板法进行初筛和复筛,DNS法测定酶活力.结果分离出126株菌株,其中8株菌株纤维素降解能力较强.结合形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析,鉴定8个菌株均属于芽孢杆菌属,其中1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),1株阿萨尔基芽孢杆菌(B.axarquienis),2株西姆芽孢杆菌(B.siamensis),4株甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus).实验表明大熊猫肠道中存在多种降解纤维素的芽孢杆菌,其中新发现的有大熊猫源的阿萨尔基芽孢杆菌和西姆芽孢杆菌,丰富了大熊猫肠道菌群的研究,并为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源.探究了大熊猫消化道内高效的纤维素降解菌,有利于实现高纤维类饲料资源化利用.     

一株α-淀粉酶生产菌的分离鉴定及其产酶条件优化

平板水解圈法从土壤中分离产淀粉酶菌株。通过碘比色法测定产淀粉酶分离菌株的酶活,筛选出一株产酶量较高的菌株,鉴定其种类,并对其产酶条件优化及酶学性质进行研究。通过革兰氏染色、生化鉴定和16SrDNA序列比对鉴定该菌的种类;从pH、温度、碳源、氮源等方面进行产酶条件优化。菌种经16S rDNA PCR序列分析比对,为枯草芽孢杆菌,因此将分离到的菌株命名为Bacillus subtislis-Y9;菌株最佳培养基配方为：淀粉6g,酵母膏13g,氯化钠5g,添加1.0%的吐温于1000mL蒸馏水中;最佳培养条件为：初始pH值为7.5;培养温度为37℃,培养时间36h。在上述培养基和优化培养条件下菌株发酵液的α-淀粉酶酶活达到7.1U/mL,约为出发菌种的5.5倍。酶学研究显示,α-淀粉酶的最适反应温度为40～60℃,反应体系pH值为6.6,并需添加0.5%CaCl2。     

一株益生芽孢菌株的分子鉴定及其药敏分析

从健康土鸡盲肠中筛选出具有益生潜力的菌株Y31,利用细菌16SrDNA通用引物对其16SrRNA进行PCR扩增,得到1460bp的片段,该PCR产物序列通过Blast软件在NCBI网站中进行同源性比较,通过Mega3.1软件绘制系统发育树;同时,选择兽医临床上常用的15种抗生素,对菌株Y31进行药敏试验。结果表明,菌株Y31的16SrRNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16SrRNA序列的相似性为99.6%,在系统发育树中,它们在同一分支,且遗传距离最短,确定菌株Y31为枯草芽孢杆菌;Y31菌株对氨苄西林、青霉素及诺氟沙星有很强的耐药性,对链霉素中度敏感,而对试验中的其它抗生素高度敏感。     

利用比较基因组学方法预测短小芽孢杆菌转录调控网络

为探讨短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的基因调控关系,通过在其亲缘关系最近的模式菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中寻找同源转录因子及其调控基因的方式,预测出B.pumilus的候选转录调控网络;并利用转录因子绑定位点的位置权重矩阵(Positional Weight Matrix)在B.pumilus全基因组的基因上游区域扫描motif的方式来验证候选转录调控网络;最后再整合其他B.pumilus专属的调控数据,最终形成一个较完备的B.pumilus基因转录调控网络（包含195个转录因子和1201个受控基因）.上述结果表明,在细菌中,利用比较基因组学的方法,以一个被广泛研究的模式生物所积累的基因转录调控关系数据为基础,推测出亲缘关系较近的其他物种的基因调控网络,其结果是可靠的,为探索一些尚不具备大规模基因表达芯片数据的物种的基因调控网络提供了一种可行的方法.     

洗毛用枯草芽孢杆菌产蛋白酶发酵条件优化

 用响应面法(Response Surface Methodology,RSM)对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）液体发酵产蛋白酶的发酵条件进行快速优化。首先运用逐因子试验确定Bacillus subtilis产蛋白酶的最佳碳源和氮源分别为糊精和玉米粉。在此基础上,通过Plackett-Burman设计对影响其产酶相关因素进行评估,并筛选出具有显著效应的3个因素：糊精、玉米粉和酵母膏。在用最陡爬坡试验逼近以上3个因子的最大响应区域后,采用RSM法对以上3个显著因子的最佳水平范围进行研究,通过对二次多项回归方程求解,确定其最优发酵条件为：糊精11.568g/L,玉米粉22.462g/L,酵母膏10.202g/L,NaCl 5g/L。初始pH值为7.0,37℃培养48h。最终优化后的酶活达到3281.79U/mL,比初始酶活2463.95U/mL提高了33.19%,证明RSM法优化洗毛用Bacillus subtilis产蛋白酶发酵工艺是可行的。     

贝莱斯芽孢杆菌BR-01菌株高产抗菌肽培养基的优化及其抗菌肽的鉴定

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) BR-01菌株对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)具有较好的拮抗作用。为了提高该菌株的抗菌肽发酵产量和生防价值,对其产抗菌肽培养基进行了优化,并初步鉴定了其抗菌肽的成分。以B.velezensis BR-01菌株无菌发酵滤液对Xoc的抑菌圈直径为评价指标,从7种常见培养基中筛选出最适培养基,通过单因素试验优化初始培养基各组分含量和发酵条件,再利用Plackett-Burman (PB)试验筛选出影响发酵滤液抑菌活性的显著因素,运用响应面分析法获得最优发酵条件。利用PCR分析B.velezensis BR-01基因组中抗菌肽合成相关基因;使用液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometer, LC-MS)技术鉴定其产生的抗菌肽。结果表明,B.velezensis BR-01菌株最佳抗菌肽培养基配方与发酵条件为麦芽糖11.89 g/L、酵母提取物13.54 g/L、NaCl 5 g/L、KH₂PO