人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

Spindlin 1编码的蛋白质定位于细胞核并使NIH3T3细胞发生恶性转化

研究了卵巢癌中高表达的新基因spindlin1的亚细胞定位及其对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响, 并探讨了人spindlin1基因的生物学功能. 采用脂质体转染法将构建的融合蛋白表达载体pEGFP-N1/ pEGFP-N1-spindlin1瞬时转染COS-7细胞,观察spindlin1基因的亚细胞定位;同时稳定转染NIH3T3细胞,经G418抗性筛选后,用RT-PCR筛选并鉴定表达spindlin1的稳定细胞株;通过细胞增殖活性、流式细胞检测、软琼脂克隆形成、迁移实验及裸鼠成瘤等对转染细胞的生物学行为进行检测. 结果表明,spindlin1定位于胞核;并促进NIH3T3细胞的增殖,使其处于G2/M期的细胞比例显著增加;同时证实过表达spindlin1的NIH3T3细胞不仅具明显的克隆形成及迁移能力,而且能使裸鼠成瘤. 由此我们得出结论:spindlin1基因过表达可促使NIH3T3细胞发生恶性转化,提示spindlin1可能是一种与肿瘤形成相关的原癌基因.     

结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的构建及表达

构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRV和Hindm双酶切合HSP65-IL-2融合基因的pPaO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（-）中,重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体瞬时转染COS-7细胞,并通过间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。重组真核表达质粒酶切后可获得约2067bp的融合基因HSP65-IL-2片段,间接免疫荧光检测重组质粒转染的COS-7细胞,可在细胞胞浆中看到特异性的绿色荧光。成功地构建了结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

siRNA干扰p38α上调人血管eNOS基因启动子转录活性

目的:通过靶向 p38α的siRNA干扰人血管内皮细胞的 p38α信号通路,探索其对血管内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调节作用.方法:利用 Western 印迹检测 siRNA-p38α干扰HUVEC-12细胞后 p38α蛋白的表达,确定 siRNA-p38α的最佳作用时间和浓度,然后通过双荧光素酶报告基因技术检测转染 siRNA-p38α后细胞裂解液的荧光强度,分析eNOS基因启动子的转录活性变化.结果:与对照组比较,siRNA-p38α干扰后 p38α蛋白表达明显减弱,而相应的 eNOS启动子转录活性上调, 以100 nmol/L 的 siRNA-p38α作用 48 h 的效果最佳.结论:siRNA干扰 p38α信号可上调人血管内皮细胞 eNOS基因的转录活性.     

gD2 DNA疫苗诱导细胞免疫应答

用生殖器疱疹gD2 DNA疫苗pcDNA3-gD转染哺乳动物细胞COS-7,鉴定gD表达．再用其免疫BALB／c小鼠,测定脾细胞增殖、CTL细胞杀伤活性,以及CD4^ 和CD8^ 细胞群．结果表明：pcDNA3-gD能够在哺乳动物细胞COS-7中表达gD抗原,其免疫小鼠脾细胞增殖活性增加,CTL活性达37．69％,明显高于pcDNA3组和生理盐水组;CD4^ 占T细胞数量的33．38％,数量较pcDNA3组和生理盐水组显著增加．     

结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合基因稳定转染细胞系的建立

建立可稳定表达结核分枝杆菌HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染P815细胞系. 在阳离子脂质体作用下,将HSP65-hIL-2真核表达质粒转染与BALB/c 遗传背景一致的P815细胞(H-2d).G418筛选阳性克隆,RT-PCR和间接免疫荧光法检测目的蛋白的转录和表达. 阳性克隆细胞经RT-PCR检测到HSP65-hIL-2融合基因特异性的mRNA表达;用鼠抗人的IL-2 mAb进行间接免疫荧光检测,可在转染的P815细胞浆中观察到较强的绿色特异性荧光,而未转染细胞则为阴性.成功获得稳定表达HSP65-hIL-2融合蛋白的稳定转染细胞系,为其疫苗的CTL研究提供了合适的靶细胞.     

幽门螺杆菌cag7-n基因克隆表达及其重组蛋白对BGC-823细胞生物学的影响

目的研究克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）cag7-n基因对BGC-823细胞增殖和IL-8分泌的影响.方法采用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cag7-n基因片段,构建重组质粒pET-28a-cag7-n,转化大肠杆菌BL21,经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于BGC-823细胞,用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.结果成功克隆cag7-n基因,经镍柱纯化后可获得纯度为98%的重组蛋白.纯化蛋白浓度在100,150,200μg/mL时,培养时间延长,细胞的增殖受到抑制;在相同的培养时间,细胞的增殖程度随蛋白浓度的增加而降低.结论成功克隆了cag7-n基因,并在大肠杆菌BL21中表达,经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白,纯化透析后的蛋白与BGC-823细胞共培养,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达及其对BGC-823细胞增殖的影响.     

兔IL-15蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫学活性

用特异性引物扩增出兔IL-15基因片段,用KpnI和NotI双酶切后将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAIL-15。将pPICZαAIL-15用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1.5%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果SDS-PAGE电泳可在重组酵母菌培养物上清中检测到分子量为18.6kDa大小的重组蛋白。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1.5%甲醇诱导144h后,重组IL-15表达量约占培养物上清总蛋白量的6.1%~8.6%。将重组IL-15用Ni离子亲和层析纯化后,在MTT试验中表现出明显的促进淋巴细胞的增殖反应,证实表达的重组IL-15具有天然蛋白的免疫学活性。     

融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

过表达BMP7对HL-7702细胞功能的影响

目的建立HL-7702细胞BMP7基因转染细胞系,并检测其增殖和迁移能力的变化。方法脂质体介导方法转染细胞,采用RT-PCR、western-blot方法检测其mRNA及蛋白表达以评价其转染效果;用MTT、划痕实验检测转染后增殖及迁移能力的变化。结果成功建立转染细胞系,转染BMP7基因后HL-7702细胞增殖和迁移能力有所增强。结论 BMP7基因高表达可能是肝细胞癌变的原因之一。     

荔枝龙眼炭疽病和霜疫霉病的识别与防治

总结了荔枝龙眼重要病害炭疽病和霜疫霉病的症状、病原、发生规律及综合防治措施;指出荔枝龙眼炭疽病和霜疫霉病主要为害叶片、花穗和果实,叶片早落,花穗干枯死亡,果实腐烂并产生异味;两种病害为害造成的损失很大,防治必须及时,且防治措施以农业防治和化学防治为主。     

中胚花筒螅辐射幼体附着和变态及其温盐效应

研究了中胚花筒螅辐射幼体的附着和变态过程以及不同温、盐度对辐射幼体附着和变态的影响.结果表明幼体的附着分为暂时性附着及永久性附着两个阶段;幼体附着变态的适宜盐度范围为23～41;适宜温度范围为13～21℃;在较低温度下(9～17℃),幼体可逆性ATT附着时间延长,有利于幼体对附着基底的选择及幼体的扩散.     

中胚花筒螅辐射幼体附着和变态及其温盐效应

研究了中胚花筒螅辐射幼体的附着和变态过程以及不同温、盐度对辐射幼体附着和变态的影响．结果表明幼体的附着分为暂时性附着及永久性附着两个阶段；幼体附着变态的适宜盐度范围为23～41；适宜温度范围为13～21℃；在较低温度下（9～17℃），幼体可逆性ATT附着时间延长，有利于幼体对附着基底的选择及幼体的扩散．     

桩土摩擦粘着特性及分析方法

同一土层的桩侧摩阻力在不同条件下取值会有很大区别,因此有必要对桩侧摩阻力的影响因素进行分析。分析了桩土的摩擦粘着机理,指出影响侧摩阻力的因素主要为桩土界面强度及土层强度,其中桩土界面强度包括界面摩擦力和界面粘着力两部分。根据机理分析提出使用有限元法配合试验结果进行分析应包括两方面的(1)根据试验实测结果通过试算确定侧摩阻力极值由桩土界面强度决定还是由土层强度决定;(2)若侧摩阻力由界面强度决定则根据土层特性进行摩擦系数假定,进而确定界面摩擦力及粘着力。介绍了ADINA建模及计算过程。通过应用一组混凝土短桩的静载试验结果进行计算分析来说明分析过程。     

镁合金板带生产应用现状与发展前景

通过对目前镁合金板带的生产技术、工艺设备和产品应用现状等方面的描述,分析了其生产与应用的特点.同时,通过介绍镁合金板带生产工艺的开发现状,探讨了其发展趋势与前景,尤其是以热轧开坯进行卷式法生产的可能.     

科技出版与科技学术道德

本文从科技出版的角度探究和思考了当前关注的学术腐败问题，对学术腐败产生的原因、学术腐败在科技出版中的表现以及科技出版如何抵制学术腐败进行了分析，提出了解决问题的意见。     

海洋科技发展演变的影响因素及规律探析

海洋科技在漫长的发展演变过程中,由于多种因素的交织作用而形成了特有的发展规律。基于分析影响海洋科技发展的诸如政治、经济、军事等各种因素,探讨海洋科技发展演变规律,有利于深层次理解海洋科技的发展历程、正确把握其发展脉络,并对未来的走势作出科学预测。     

公民的法律理解-解释与和谐社会的治理及建设

基于对公民法律理解-解释问题的分析引出了对公民的法律理解-解释活动与和谐社会善治的内在关系的探讨。和谐社会的善治模式内在地蕴含了公民法律理解-解释的要素,这是构建和谐社会重要的心理基础。公民法律理解-解释活动过程对于和谐社会的建设所具有社会整合作用,正确引导与教育以及优化公民法律理解-解释活动是公民意识教育的重要内容。     

科技腾飞与文学发展

科技腾飞与文学发展是全球语境中的一个重要话题。针对这一话题主要有两种观点:持悲观论调者认为科技腾飞导致文学终结;持乐观论调者认为科技腾飞带来文学进步。究竟谁是谁非是理论界亟待解决的关系到文学及其研究是存在还是消亡的根本性问题。本文认为科技腾飞既没有导致文学的终结也没能带来文学的进步,而是推动了文学的全面发展。这种发展表现为:一,现代科技媒介与制作方式为文学发展拓宽了空间,生产了新的文学种类,为文学大家庭增添了新成员;同时也改变了文学的活动方式。二,新的文学种类的出现、文学活动方式的改变以及高科技时代的后现代语境,使文学的价值功能发生变化,从而赋予文学以鲜明的时代特征———大众的、消费的品格。     

沿河防洪堤滑坡处理、基础处理与稳定性分析

介绍沿河城区防洪堤0＋440－0＋486段边坡病害概况及产生原因，提出了边坡排水、清刷滑体和防护加固相结合的综合整治工程措施，并用条分法对该边坡进行了稳定验算。为满足防洪堤稳定性要求，对滑坡段基础采取了挖齿槽、打描杆等措施，并对该基础进行了稳定性分析。