三种PCR引物法制备生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因cDNA探针检测效果的比较

采用正义、反义引物及正义和反义引物双链PCR法制备了生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因的cDNA探针。检测结果表明，三种PCR引物法标记的cDNA探针显色灵敏度均可达到10ps／μL，对目标基因DNA的检测灵敏度可达90ps／μL，但反义引物PCR法标记探针的检测效果要好于正义和反义引物双链PCR法制备的探针；在目标基因DNA浓度一定的情况下，探针的浓度对检测效果的影响并不大；正义、反义引物PCR法制备的探针可不经煮沸变性处理直接使用；用50ng／mL浓度的反义引物PCR法制备的生物素标记cDNA探针可检测到带毒啤酒花叶片和花瓣中的啤酒花潜隐病毒RNA。     

甘蔗SPSⅢ内含子地高辛探针的制备及检测

以甘蔗SPS基因选择性剪接保留的内含子6,7,8片段为靶序列,利用PCR扩增技术分别制备出3种地高辛标记的SPS内含子探针:SPS-intron 6探针167 bp,SPS-intron 7探针93 bp和SPS-intron8探针175 bp,并通过斑点杂交实验表明这3种探针灵敏度高,都能检测到pg级的靶核酸,且特异性好,阴性对照实验显示无杂交信号.     

用生物素标记核酸探针检测鼠金黄色葡萄球菌的研究

利用聚合酶链反应技术从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出 6 78bp耐热核酸酶nuc基因特异性片段 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验的探针 ,对实验动物的金黄色葡萄球菌及其临床样品进行了检测。结果显示 ,标记探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与链球菌、大肠埃希氏菌和巴氏杆菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交的检测灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 2 4 0份临床样品进行了检测 ,检出率为 2 9% (7 2 4 0 ) ,符合率为 10 0 %。这些试验结果表明 ,研究制备的核酸探针及建立的斑点杂交试验具有较高的特异性和敏感性 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测     

地高辛标记cDNA探针检测植物谷胱甘肽过氧化物酶基因表达及方法研究

本文利用RT-PCR和PCR技术制备地高辛标记的谷胱甘肽过氧化物酶(ATGPX3)cDNA探针,分别进行DNA和RNA斑点和印迹杂交分析.通过调整杂交液组分的浓度和增加10%硫酸葡聚糖的方法,改进杂交反应.实验结果表明,改良的方法不仅提高了杂交效率,而且明显检测到RNA杂交印迹反应.另外,利用地高辛标记cDNA探针技术也检测到了植物激素ABA诱导的ATGPX3基因的表达,同时证明了该方法可以用来检测植物基因的表达.     

转基因油菜籽多重PCR-DNA芯片联用检测方法的研究

根据转基因油菜中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、FMV35S，PAT基因和目的基因mCP4-EP-SPS，BAR，MS8，RF3以及内源PEP基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIG-dUTP标记杂交探针，并制备基因芯片，在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试，结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．1％，由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因，提高了检测的准确性和效率．     

对于基因芯片实验的动力学范围和结果可重复性的研究

杂交动力学和实验结果的可重复性是基因芯片研究中十分重要的内容，以单基因模拟芯片对DNA芯片的杂交动力学进行了初步的研究：将不同含量的植物cDNA点在玻片上制成DNA芯片，利用体外转录的方法得到植物基因的mRNA，然后通过反转录方法把荧光标记到cDNA上，用不同含量的荧光标记cDNA对芯片进行杂交，根据结果分析了靶基因和探针含量变化对芯片杂交信号产生的影响，利用多基因模拟芯片分析了不同基因的杂交动力学特点；利用12800点的高密度芯片进行了2组不同的表达谱实验，对芯片结果的可重复性做了验证。     

PCR法制备地高辛标记探针斑点杂交检测白斑综合症病毒（WSSV）

用PCR法成功制备了DIG标记探针,探针长度为547bp,探针的产量为21．6mg/μL。此探针与随机引物合成探针检测样品灵敏度相近。用此探针核酸斑点杂交法检测了54尾中国对虾。结果表明：此探针在对白斑综合症病毒的检测、对虾暴发性流行病的诊断等方面具有很高的应用价值。     

LA-PCR法制备赤麂Y2涂染探针与原位杂交

应用显微切割技术获得赤麂的Y2单条染色体,经LA-PCR（linker-adaptor PCR）扩增后用DIG标记制备探针,然后用Southern blot杂交法对所制备的探针进行验证并对毛冠鹿的中期核型进行原位杂交.结果表明：用该法制备的涂染探针是成功的,原位杂交也获得了阳性结果,可以初步验证毛冠鹿中的Y染色体.     

SRY基因在部分动物类群系统进化中保守性研究

用特异于人 HMG- box区域的一对引物 ,对脊推动物 5个纲 10个物种及 2种无脊推动物的基因组 DNA进行 PCR扩增 ,并以 dig标记的人 SRY基因为探针 ,与扩增产物进行 Southern杂交 ,结果表明 :在这 12个物种中都存在 SRY基因的同源序列 ,无脊推动物克氏螯虾及背角无齿蚌杂交中显色较慢 ,表明 SRY基因在系统进化中具有高度的保守性且同源程度与物种在进化上的地位有关     

用PCR产物制备探讨针检测EB病毒

目的：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物制备地主辛标记探针，通过斑中杂交检测鼻咽癌患咽拭子、活检组织及血标本中ＥＢ病毒ＤＮＡ。方法：按献「４」的方法，以Ｂ９５－８ＤＮ为模权进行ＣＰＲ，用ＰＣＲ产物进行地主辛标记反应获得探针。将梯度稀释的变性探针制成ＮＣ膜，与对照标记的ＤＮＡ进行比较，以测试探针的灵敏度。结果：表明标记探针的检测灵敏度可达０．１ｐｇ，有地对９例患的一（均经ＰＣＲ检测，证实ＥＢ病毒Ｄ     

双色荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病(CML)患者BCR/ABL融合基因的表达

根据常见的BCR/ABL融合基因序列,分别设计合成检测BCR/ABL融合基因和ABL基因表达的TaqMan引物、探针,其中检测融合基因表达的探针标记FAM荧光素,检测ABL基因表达的探针标记HEX荧光素,检测BCR/ABL融合基因探针标记FAM荧光素的;提取患者骨髓细胞标本总RNA,逆转录成cDNA;以其为模板在同一PCR扩增管中同时进行两种基因的双色荧光定量PCR反应,分别定量测定BCR/ABL融合基因和ABL基因的表达量,并计算两种基因表达的比值;采用该基因检测技术检测20例CML患者BCR/ABL融合基因及ABL基因的表达量,与临床诊断结果对比,判断该技术在CML检测诊断中的价值.成功地建立了双色荧光定量PCR技术方法,在20例患者中检出18例融合基因阳性,检测阳性率90％.     

寡核苷酸芯片制备及其杂交条件的优化

探讨了2种不同硅烷化试剂3-氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基丙基二乙烯基三胺及其不同处理时间对寡核苷酸探针固定效率的影响.结果表明3％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的95％丙酮溶液处理2h,然后用5％戊二醛溶液处理1 h,可以获得很好的杂交信号.对比polyT15空间子,含有相同寡核苷酸序列的PEG6、PEG12空间子能使杂交信号增强6、8倍.在以pH值9-11的碳酸盐缓冲液为点样液时,杂交信号随着pH值的逐渐升高而略有下降.寡核苷酸探针的浓度和荧光标记样品的浓度影响杂交结果,当寡核苷酸探针的浓度为25μmol、所用长度为110bp的荧光标记的PCR产物为2μL,经杂交液6×SSEPT稀释至10μL时,可以获得很好的杂交信号.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5''端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northern blot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50 pg的病毒RNA.     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP_2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV-NM)提取总RNA,经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段,并构建至pGEM-T载体中.序列测定后,将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析:同源性为40%.通过PCR法标记克隆的cDNA片段,制备地高辛标记探针,与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交,并作敏感性试验,结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性,可检测出50pg的病毒RNA.     

免疫PCR技术的策略

免疫PCR是一种新兴的免疫标记技术，具有高敏感性和特异性的特点．本文对免疫PCR的方法、DNA标记探针的构建及扩增产物的检测进行了综述．     

不同方法修饰玻璃表面制备蛋白质芯片的对比

分别采用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷、戊二醛、多聚赖氨酸、聚丙烯酰胺、琼脂糖、硝化纤维修饰玻璃表面,对6种不同修饰表面制备的蛋白质芯片进行对比研究,探讨制备蛋白质芯片的合适玻璃表面修饰方法.利用原子力学显微镜对其表面进行表征,通过点样蛋白于修饰后的玻片表面制备蛋白质芯片,比较不同修饰表面对蛋白质的固定效率和固定效果.结果发现:氨基、醛基、聚赖氨酸修饰玻片为二维平面结构,琼脂糖、聚丙烯酰胺、硝化纤维修饰玻片其表面不仅有多孔结构,而且有一定厚度;琼脂糖修饰玻片所得的荧光强度最高,背景较低,是一种理想的制备蛋白质芯片的表面修饰方法.     

人p16^INK4cDNA探针在非小细胞肺癌研究中的应用

制备总RNA,RT－PCR克隆p16^INk4cDNA,测序验证,制备探针,进行PCR产物Southern杂交检测非小细胞肺癌组织标本中p1^^INK4基因第二外显子阴性杂交率为12．9％（4／31）,原位杂交显示p16^INK4基因转录阴性率为22．6％（7／31）,结果说明克隆的p^INK4cDNA是正确的。可用于临床基因诊断,p^16INK4基因变异及表达在非小细胞肺癌的、发展中起作用。     

果蝇精子发生中CG15899的基因表达

为了检测在雄性果蝇中CG15899基因是否有特殊的表达,利用PCR的方法得到CG15899的基因片段,并用DIG标记PCR产物,将其与野生型雄性果蝇melanogaster的精巢进行原位杂交,最后在果蝇精巢的细胞质中产生了较强的信号．实验结果表明,CG15899基因在精原细胞和初级精母细胞中表达．     

蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备

从内蒙古巴盟地区分离的蓝舌病病毒株(BTV—NM)提取总RNA，经反转录PCR扩增VP2基因5′端片段，并构建至pGEM—T载体中。序列测定后，将这一序列与蓝舌病毒澳大利亚株VP2基因5′端进行比较分析：同源性为40％。通过PCR法标记克隆的cDNA片段，制备地高辛标记探针，与粗提的蓝舌病发病羊病毒RNA进行Northernblot杂交，并作敏感性试验，结果表明此探针对蓝舌病毒内蒙古分离株具有特异性，可检测出50pg的病毒RNA。     

人p16~(INK4) cDNA探针在非小细胞肺癌研究中的应用

制备总RNA ,RT PCR克隆p16 INK4 cDNA ,测序验证 ,制备探针 .进行PCR产物Southern杂交检测非小细胞肺癌组织标本中p16 INK4 基因第二外显子阴性杂交率为 12 .9% (4 / 31) .原位杂交显示p16 INK4 基因转录阴性率为2 2 .6 % (7/ 31) .结果说明克隆的p16 INK4 cDNA是正确的 ,可用于临床基因诊断 ,p16 INK4 基因变异及表达在非小细胞肺癌的发生、发展中起作用