平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

以体外成熟、体外受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冷冻效果的影响．实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻—解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２）（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻的胚胎，在２０℃水浴中解冻的发育率明显高于３７℃解冻的效果，６２．７％（３７／６２）、２６．２％（１６／６１）（Ｐ＜０．０１）．结果表明：体外成熟、体外受精的牛胚胎可以进行玻璃化冷冻保存，并能得到较高的培养存活率，在室温下，以二步法添加防冻剂，并于２０℃下解冻的玻璃化冷冻保存方法是一种快速、简便而有效的方法．     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

非极性表面活性剂对小鼠早期胚胎冷冻保护作用的初步研究

许多研究者报道了某些非极性表面活性剂在防止蛋白质低温冷冻变性方面有着明显的效果．本研究就某些非极性表面活性剂对胚胎的防冻作用作了初步探索．方法是分别将不同浓度的两种表面活性剂Ｐｏｌｙｓｔｅｎ２０（Ｐ２０）和ＳＹ－ｇｌｙｓｔｅｒＭＬ－７５０（ＭＬ７５０）添加于改进的磷酸缓冲液（ＰＢ１）和本研究采用的防冻液（ＦＳ：ＰＢ１＋３ｍｏｌ乙烯二醇＋０．２５ｍｏｌ乳糖）中，处理小鼠早期胚２０ｍｉｎ后培养并观察对胚胎发育的影响，以确定它们对胚胎的临界安全浓度（ＣＳＣ）．在ＰＢ１中，两种表面活性剂的ＣＳＣ值均为０．５％，而在ＦＳ中，则为０．０５％．然后将两种表面活性剂Ｐ２０和ＭＬ７５０分别以０．０５％和０．０３％两种浓度添加于ＦＳ中，以ＦＳ作为对照组．在室温下平衡处理小鼠桑椹胚和早期囊胚５ｍｉｎ后连同防冻液一起装入塑料冷冻细管中．在液氮蒸气（－１７０℃）中预冷冻１ｍｉｎ后即投入液氮内保存．在３８℃水浴中快速解冻并去除防冻剂后在Ｗｈｉｔｔｅｎ培养液中培养２４ｈ．分别观察和统计冷冻－解冻胚的形态正常率和发育率．结果表明：处理组与对照组在冷冻－解冻胚形态正常率方面无显著差异（Ｐ＞０．０５），而添加０．０３％Ｐ＿２Ｏ或ＭＬ７５０的两     

山羊胚胎的体外发育及冷冻保存研究

采用体外培养的方法，对山羊２～８细胞胚进行培养以后将体外发育至囊胚的胚胎进行冷冻保存，以便探讨山羊早期胚的体外培养方法和冷冻方法对体外发育胚冷冻效果的影响。将胚胎分别放入Ｍ１９９、Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞和Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞＋ＥＧＦ的培养液中进行培养，选取发育至囊胚期的胚胎分别以甘油和乙二醇为冷冻保护剂进行冷冻保存。结果体外培养胚的囊胚发育率在三个处理组中分别为１２．５％、７０．６％和７６．９％。使用Ｍ１９９处理组与添加输卵管上皮细胞、添加输卵管上皮细胞和ＥＧＦ的处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。冷冻解冻胚的形态正常率和发育率在以甘油和乙二醇为防冻剂的处理组中分别为６８．７、５８．３％和７８．６％、７２．８％。两组之间无明显差异，结果表明，采用与输卵管上皮细胞共同培养的方法能够提高山羊胚胎体外培养的发育率，以甘油和乙二醇为冷冻防冻剂均适合于山羊体外发育胚的冷冻保存，两者相比乙二醇的效果略优于甘油。     

玻璃化冷冻保存小鼠受精卵的研究

在20°C室温下,用玻璃化冷冻液(含体积分数为0.3的乙二醇、0.21kg/L的葡聚糖和0.35mol/L的海藻糖)对昆明纯种小白鼠受精卵进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存.一步法的2min平衡组(39%)和二步法的1min平衡组(41%)的胚胎解冻后存活率较好,与对照组(83%)相比有极显著差异(p<0.01).在玻璃化冷冻效果较好组胚胎的子宫移植中,妊娠受体率、妊娠受体产仔率和移植受体产仔率均与对照组无显著差异(p>0.05).     

小鼠囊胚玻璃化冷冻保存研究

在20°C室温下,用玻璃化冷冻液(体积分数为0.4的乙二醇,质量浓度为0.18kg/L的葡聚糖和0.3mol/L海藻糖)对昆明小白鼠囊胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存.一步法的1min平衡组和二步法的0.5min平衡组胚胎解冻后,体外培养24h后的发育率较高,都为91%,与对照组(98%)相比无显著差异(P＞0.05);体外培养48h后的囊胚孵化率较好,分别为48%和51%,但与对照组(90%)相比,均有极显著差异(P＜0.01).将此两组冷冻囊胚植入假孕3d的受体鼠子宫内,其产仔率分别为43%和50%,与对照组(55%)相比,均无显著差异(P＞0.05).     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻后孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的囊胚经冷冻—解冻后的孵化能力．在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,囊胚经冷冻—解冻后的孵化率为４７．７％．研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无显著差异（Ｐ＞０．０５）．     

体外培养高产奶牛胚胎的研究

研究体外培养法培养效果及对体外受精胚胎发育的影响。体外受精胚胎分别在加输卵管上皮细胞单层和颗粒细胞单层（2×106个／ml）的体外培养体系的培养液中培养。结果发现,冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著（P〈0．01）;冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05）,解冻后A级胚胎存活率79％、囊胚孵化率56％,显著高于B级胚胎存活率60％和囊胚孵化率39％（P〈0．05）。体外培养体系囊胚形成主要集中在第8d,加体细胞的体外培养体系显著好于不加体细胞的简单体外培养法。     

不同体外培养系统对牛体外受精胚胎冷冻解冻的孵化能力的影响

采用ＳＯＦ和ＴＣＭ１９９与输卵管上皮细胞共同培养系统对牛体外受精卵进行培养,观察了在这两种培养条件下得到的襄胚经冷冻－解冻后的孵化能力,在ＳＯＦ＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２１．３％,襄胚经冷冻－解冻后的孵化率为３７．５％;在ＴＣＭ１９９＋输卵管上皮细胞的培养条件下,囊胚的发育率为２６．０％,衰胚经冷冻－解冻后的孵化率为４７．７％,研究结果表明这两种体外培养系统的培养效果无明显差异     

小鼠胚胎冷冻方法的研究

本试验共用小鼠胚胎7858枚,对冷冻-解冻小鼠胚胎过程中的一些环节进行了对比试验,结果表明,冷冻过程中诱发结晶温度最好为-7℃左右,致冷时间以15—20秒为宜。致冷时间过长或过短都会引起解冻后胚胎成活率的下降。将胚胎缓慢冷冻至—0——40℃再投入液氮可获得较理想成功率。而—25℃以前投入液氮的胚胎其解冻后体外发育能力明显不如—30℃以后投入者。将胚胎冷冻管投入液氮的方式,对解冻后胚胎的形态和体外发育能力均有显著影响。将胚胎冷冻管插入液氮深部的效果显著优于漂浮于液氮表面者。添加甘油的方法对解冻后胚胎的体外发育能力无显著影响,三步添加甘油和一步添加甘油的胚胎,在解冻后培养的发育率和膨胀率方面均无显著差异。脱除甘油的方法明显影响解冻后胚胎的体外发育能力,在1/3M蔗糖液中分步脱除甘油的方法。明显优于在0.5M蔗糖液中一步脱除法。缓慢冷却至—36℃投入液氮的胚胎,在30～35℃水浴中解冻后体外培养成活率最高,而在0℃,10℃和20℃解冻的胚胎成活率明显降低。     

乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的 评价用乙二醇玻璃化冷冻液二步法对长爪沙鼠 2-细胞胚胎冷冻保存的效果。方法 通过超排卵处理 后与雄鼠交配获得长爪沙鼠 2-细胞胚胎,胚胎在冷冻液 EFS20 中平衡 3 min,然后移入冷冻液 EFS40 中平衡 1 min, 之后将细胞冻存管直接浸入液氮中保存。采用二步法复苏胚胎,复苏后移入改良的胚胎培养液( mKSOM) 中体外 培养。结果 采用该方法冷冻的胚胎复苏后胚胎回收率为 86. 73% ,存活率为 82. 94% ,复苏后存活的胚胎中约 1 / 3 胚胎可以在体外发育到囊胚。结论 乙二醇玻璃化冷冻液适于冷冻保存长爪沙鼠 2-细胞胚胎。     

细胞松弛素B、温度、离心处理对猪卵母细胞OPS玻璃化冷冻的影响

主要探讨使用CB预处理和不同温度冷冻保护剂对猪卵母细OPS玻璃化冷冻保存的影响,并对使用不同温度冷冻保护剂下,探讨离心猪卵母细胞后的OPS冷冻、解冻的效果.结果表明,体外成熟培养12h后,将经7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)处理的猪卵母细胞进行OPS玻璃化冷冻保存.解冻后继续体外成熟培养,猪卵母细胞的形态正常率和成熟率与对照组无显著差异(P>0.05),但是与对照组相比,经冷冻前经CB预处理的卵母细胞其体外受精胚胎的卵裂率、桑葚胚和囊胚率显著提高(P<0.05).此外,使用预平衡至39℃的冷冻保护剂能够达到较好的解冻效果,卵母细胞成熟率较高,但离心并没有促进冷冻后猪卵母细胞体外受精胚胎发育率.     

静电场对小鼠体外受精胚胎质量的影响

利用静电场处理体外受精（ＩＶＦ）小鼠原核期胚胎，并在体外进行发育培养，在此过程中通过观察ＩＶＦ胚胎的发育速度及冷冻－解冻后囊胚孵化率，探讨了静电场对小鼠ＩＶＦ胚胎质量的影响，实验结果显示，授精处理后８４ｈ，处理组的囊邳经（４６．５％）显高于对照组（２５．５％），并且到１０８ｈ时，处理组的囊胚孵化率（９４．４％） 于对照组（６０．０％），表明静电场处理与对照组无差异，然后囊胚孵化率却高于组１８．４     

影响玻璃化法冷冻保存胚胎的一些因素

探讨了用玻璃化法冷冻保存小鼠桑椹胚的一些影响因素。冷冻胚胎的保护剂采用性质较温和的甘油和1,2-丙二醇组成的玻璃化液,以37℃,体积分数5％CO2条件下能发育到囊胚期为保持正常生命力的指标。结果表明,玻璃化液中的甘油和丙二醇的浓度是冷冻保存胚胎的关键因素,而甘油和丙二醇比例对保存效果也有影响。在所用的不同组合的玻璃化液中,含2．5mol／L甘油和3．5mol／L1,2-丙二醇效果最好。0．25mL的冷冻管比0．5mL的效果更好。     

Lats基因敲除小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究

用冷冻麦管、细胞冷冻管分别采用一步法和二步法对Lats基因敲除小鼠胚胎进行玻璃化冷冻 ,胚胎解冻后 ,囊胚发育率分别为 90 %、90 1%、89 2 %和 91 4 % ;移植后着床率分别为 :5 0 0 %、4 7 1%、4 3 4 %和 4 6 5 % ,差异不显著 ;并且与对照组相比差异也不显著。因此 ,玻璃化冷冻可以作为Lats鼠保种方法之一     

大鼠早期胚的快速冷冻保存

为建立大鼠胚胎冷冻保存库探索一种经挤有效的冷冻处理技术,本文着重探讨了两种不同的快速冷冻处理方法(1.把胚胎先在—30℃下保持60分钟后投入液氮;2.在液氮蒸气中停留5分钟后投入液氮)及四种不同的防冻液(添加2.8M甘油,0.5M蔗糖的PBS 20％大鼠血清或胎牛血清,生理盐水 20％大鼠血清或胎牛血清)对大鼠早期胚冷冻-解冻后发育率的影响。实验结果表明,在液氮蒸气中保持5分钟后投入液氮比在-30℃下保持60分钟的效果好,防冻液内添加胎牛血清(FCS)比大鼠血清(RS)效果好,PBS与生理盐水之间无明显差异。以含有2.8M甘油,0.5M蔗糖的PBS 20％FCS作为防冻液,用第二种方法进行冷冻处理的大鼠早期胚解冻后其发育率为81％,把用上述方法处理的135枚发育胚移植到17只受体鼠的子宫角内,有2只妊娠产仔4只。     

不同解冻方法对辽宁绒山羊精子活力的影响

通过比较三种精液冷冻保存稀释液配方（A、B、C）对山羊细管冷冻精解冻后精子活力的影响,结果表明,三种稀释液配方（A、B、C）,冷冻-解冻后精子活力有极显著的差异（P〈0．01）,分别为42．57％、37．34％、33．03％,A显著优于B液和C液．而且用不同的水浴温度和解冻时间进行解冻,通过精子活力的比较,寻找出最佳的解冻温度为38℃,解冻时间为60s．     

牛体外受精卵的冷冻保存研究

将胚胎分别以PBS 20?S 10%乙二醇和PBS 20?S 10%甘油为冷冻保护液,或者在PBS 20?S 10%乙二醇中添加或不加蔗糖为保护液,用常规冷冻方法进行冷冻处理.胚胎保存1～18天后将其解冻,并在发育用培养液TCM199 10%OCS(发情母牛血清) 丙酮酸钠中培养48小时.结果表明解冻胚的形态正常率和培养后的发育率在乙二醇处理组和甘油处理组中分别为81.2%(13/19)、56.2%(9/16)和84.6%(11/13)、46.2%(6/13),两组之间无量著差异.在添加蔗糖和不加蔗糖的处理组中,胚胎解冻后的形态正常率和培养后的发育率分别为75.0%(15/20)、55.0%(11/20)和83.3%(15/18)、61.1%(11/18),两组之间也无明曼差异.试验结果证明,用乙二醇为防冻剂对牛体外受精胚胎进行冷冻保存,其效果相当于或略优于甘油,在乙二醇处理组中,添加蔗糖与否并不影响其冷冻效果.     

奶牛胚胎简易快速冷冻及其移植试验研究

将7日龄的黑白花奶牛胚胎,采用简易冷冻仪,以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻法对胚胎进行冷冻.甘油作冷冻保护剂,以1℃/min的速度由室温降至-7℃,在-7℃下绣发结晶,并在-7℃下维持5分钟;又以0.3℃/min降到-10℃,最后以0.5℃/min速度降至-30℃,平衡10分钟后,胚胎直接投入液氮罐申保存。需移植时,直接在37℃温水中解冻。本试验解冻了25枚胚胎,取1,2级胚胎15枚,除去甘油后,将15枚胚胎用凯氏枪输卵器分别移植给15头同期受体的的母牛,现已产下3头牛犊.结果表明,采用简易冷冻仪、以液氮作冷冻源的快速冷冻、解冻的胚胎可以成活,且有利在生产实践中推广应用。     

冷冻保存小鼠胚胎简易方法的研究

小鼠胚胎在冷冻保护剂二甲亚砜(DMSO)存在下,冷冻到-196℃,解冻以后可以存活。在无胚胎冷冻机的条件下,我们用简易冷冻装置,将不同胚龄的鼠胚放入其中,经缓慢降温后保存于液氮内。冷冻胚胎快速解冻后,胚胎回收率达67—79%。选择解冻后正常胚胎进行体外培养,48—72小时后能进一步发育为其存活标准,冷冻后胚胎存活率为66.07%。此方法简便易行便于推广。