昆明小鼠未成熟卵母细胞OPS和SSV冷冻保存的比较

目的寻找昆明小鼠卵母细胞冷冻保存效率的新途径。方法选用5~6周龄雌性昆明小鼠的未成熟卵母细胞,在不同前处理液(10%EG或10%EG+10%DMSO)中平衡5 min,然后在冷冻液(EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40)中平衡30 s后进行OPS(Open pulled straw)法和SSV(Solid-surface vitrification)法玻璃化冷冻保存。结果小鼠未成熟卵母细胞的OPS法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为84.4%,成熟率低于16.7%;而在SSV法冷冻保存中,用EFS液冷冻的卵母细胞解冻后形态正常率最高为86.0%,成熟率为46.5%。OPS法和SSV法冷冻小鼠未成熟卵母细胞形态正常率为91.6%和91.4%,与对照组间差异较显著(P>0.01);成熟率为42.9%和59.1%,与对照组差异极显著(P<0.01)。结论多种抗冻保护剂组合使用效果好于单种抗冻保护剂;EDFS冷冻液冷冻保存效果好于EFS,尤其是EDFS30;OPS法可以有效地冷冻保存小鼠未成熟卵母细胞,且新型玻璃化冷冻法SSV法冷冻保存效果优于OPS法。     

平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

以体外成熟、体外受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冷冻效果的影响．实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻—解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２）（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻的胚胎，在２０℃水浴中解冻的发育率明显高于３７℃解冻的效果，６２．７％（３７／６２）、２６．２％（１６／６１）（Ｐ＜０．０１）．结果表明：体外成熟、体外受精的牛胚胎可以进行玻璃化冷冻保存，并能得到较高的培养存活率，在室温下，以二步法添加防冻剂，并于２０℃下解冻的玻璃化冷冻保存方法是一种快速、简便而有效的方法．     

不同冷冻方法和解冻液对猪精液冷冻效率的影响

采用三种不同的冷冻方法冷冻猪的新鲜精液,再分别用不同的解冻液在相同条件下同时解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率,以优化猪精液冷冻方法.实验一:随机选取三头健康的有稳定受精能力的优良种公猪,采集新鲜精液,分别用干冰颗粒、液氮颗粒和液氮细管三种方法冷冻,用同样的方法解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率;实验二:用不同的解冻液解冻经干冰颗粒法冷冻的精液,对比不同解冻液对精子活力的影响;实验三:以孤雌激活和鲜精受精为对照,验证经实验一和实验二选择出来的最优冷冻方法和解冻液处理后的精子的体外受精能力.实验一显示,干冰颗粒冷冻法冷冻的猪精液解冻后精子活力(0.23)略高于液氮颗粒法的精子活力(0.20),而二者均显著高于细管冻精法的精子活力(0.08)(P<0.05),液氮颗粒法的顶体完整率(54.7%)和细管法的顶体完整率(54.2%)无显著差异,但二者均显著低于干冰颗粒法的顶体完整率(58.0%)(P<0.05).实验二显示,Glucose-EDTA解冻液解冻后,精子活力(0.22)显著高于DPBS-BSA解冻液解冻后的精子活力(0.13)(P<0.05).实验三:经干冰颗粒法冷冻、Glucose-EDTA解冻液解冻的精液,体外受精后的囊胚发育率(17.6%)与鲜精体外受精囊胚率(17.9%)无显著差异,但二者均显著低于孤雌激活对照组的囊胚率(36.6%)(P<0.05).由此可知:干冰颗粒法冷冻结合Glucose-EDTA解冻液解冻是较为理想猪精液冷冻保存方法,经该方法冷冻、解冻的猪精液,体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异.     

小鼠胚胎GMP玻璃化超低温保存研究

本实验研究了GMP法(glassmicropipette)冷冻保存小鼠胚胎的主要技术环节,并与目前常用的OPS(openpulledstraws)法比较了冷冻后囊胚率.实验表明,EFS30(87.71%)保护作用比EFS40(81.67%)好,但无显著差异(P>0.05);10%EG(91.37%)预处理优于5%EG(85.93%)、20%EG(88.70%),但差异不显著(P>0.05);玻璃化时间10～30s(89.47%、86.79%)显著优于(P<0.05)60s(64.00%).GMP法与OPS解冻后囊胚率分别为94.02%和92.06%,差异不显著(P>0.05),但GMP法稍好于OPS法.同时,GMP法操作比OPS法更简便.     

小鼠胚胎GMP玻璃化超低温保存研究

本实验研究了GMP法(glass micropipette)冷冻保存小鼠胚胎的主要技术环节,并与目前常用的OPS(open pulled straws)法比较了冷冻后囊胚率.实验表明,EFS30(87.71%)保护作用比EFS40(81.67%)好,但无显著差异(P＞0.05);10%EG(91.37%)预处理优于5%EG(85.93%)、20%EG(88.70%),但差异不显著(P＞0.05);玻璃化时间10～30 s(89.47%、86.79%)显著优于(P＜0.05)60 s(64.00%).GMP法与OPS解冻后囊胚率分别为94.02%和92.06%,差异不显著(P＞0.05),但GMP法稍好于OPS法.同时,GMP法操作比OPS法更简便.     

细胞及玻璃化冷冻保护剂显微实验研究

利用低温冷冻显微实验平台,测定了DMSO和甘油两种保护剂的凝固点和玻璃化条件.采用4种不同的冷冻方案对SD大鼠的成骨细胞进行了低温冷冻保存研究.实验结果表明冷冻保护剂的凝固点温度随保护剂浓度和降温速率变化而变化,玻璃化的产生需要很高的保护剂浓度或很快的降温速率.保护剂的性能、冷冻和解冻程序及冻存时间是影响冷冻细胞比活的关键因素.所得结论对研究不同的细胞系、不同尺度组织的最佳低温冷冻保存方案具有指导意义.     

小鼠不同杂交组合胚胎玻璃化冷冻的研究

通过小鼠胚胎的毒性试验 ,确定对胚胎无毒性或毒性小的冷冻保护剂的种类、适宜浓度 ,以便达到提高冷冻解冻后的胚胎存活率的目的。用小鼠不同杂交组合胚胎进行玻璃化冷冻和解冻后 ,经体外培养观察胚胎的存活率和囊胚孵化率 ,确定了最佳的杂交组合     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

小鼠胚胎冷冻技术的研究进展

传统胚胎冷冻技术如OPS、冷冻环、冷冻帽、冷冻膜等,在胚胎复苏率和囊胚形成率、技术可行性、温度适用范围、冰冻和解冻速率等方面各具有其特定优缺点,在实际推广和应用中存在一定局限性。本文就新型微滴式玻璃化(Modified droplet vitrification,MDV)胚胎冷冻技术和高重量渗透摩尔浓度玻璃化(High osmolality vitrification,HOV)两种新型胚胎冷冻保存技术进行概述,并阐明胚胎冷冻保存及复苏发育过程中所受温度、饮食中植物雌激素、N-乙酰半胱苷酸等参数的影响。     

猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢，用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体，对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究，根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度，合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关，大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷…

以体外成熟，体外受受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冻冷效果的影响。实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻一解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻     

人类低品质精液的一步冷冻保存

男性不育症有部分病因是由于低品质精液因素所致,对这类精液进行冷冻保存有助于临床结合生殖工程技术实施治疗。近年人类精液冷冻保存方法学有了很大进展,但低品质精液体外处理结合一步冷冻的效果尚无报道。低品质精液按照其低精子参数分成3组：1组（低精子计数组,n二6）,11组（低精子活动率组,n＝11）,皿组（低正常精子形态率组,n＝8）。1组用BWW生理液洗涤、离心制备成精子悬液。3组的精子悬液与冷冻保护剂等量混匀后吸人IInL聚丙烯注射器,直接置一196T一步冷冻和保存。经体外处理精子后的3组标本,解冻后的精子复苏率分别为（…     

利用不同冷冻方法建立大鼠胚胎保种库的研究

采用程序冷冻、玻璃化冷冻和OPS法对大鼠囊胚进行了冷冻保存,探讨了不同冷冻方法对胚胎存活率的影响,解冻后存活率分别为82．4％,76．9％,85．7％;孵化率分别为47.1%,46.1%,53.6%。3种方法所得的囊胚存活率及孵化率均无显差异,均可作为对大鼠囊胚进行冷冻保存的有效方法,可用于胚胎建库。     

公鸭、公鸡精子对在液氮中低温冷冻保存耐受力的比较研究

比较公鸭和公鸡精子经低温冷冻保存后存活率、顶体完整率方面的差异.结果表明,公鸭冷冻精液解冻后的精子存活率和顶体完整率都不同程度地高于相同类型的公鸡冷冻精液,但差异均未达到显著水准（P＞0.05）.     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

小鼠囊胚玻璃化冷冻保存研究

在20°C室温下,用玻璃化冷冻液(体积分数为0.4的乙二醇,质量浓度为0.18kg/L的葡聚糖和0.3mol/L海藻糖)对昆明小白鼠囊胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存.一步法的1min平衡组和二步法的0.5min平衡组胚胎解冻后,体外培养24h后的发育率较高,都为91%,与对照组(98%)相比无显著差异(P＞0.05);体外培养48h后的囊胚孵化率较好,分别为48%和51%,但与对照组(90%)相比,均有极显著差异(P＜0.01).将此两组冷冻囊胚植入假孕3d的受体鼠子宫内,其产仔率分别为43%和50%,与对照组(55%)相比,均无显著差异(P＞0.05).     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响

为研究卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了年龄、成熟方式及培养液对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响.1.5月龄、3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠的GV期卵母细胞其体外成熟率无差异(P0.05).经人工活化后,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率都明显降低;体外成熟的生长在HTF培养液的卵母细胞发育到2-细胞期胚的比率(44.4%)显著高于生长在M16培养液的比率(22.9%)(P0.01).结果表明昆明白小鼠卵母细胞的体外成熟不受年龄影响,体外成熟的卵母细胞人工活化后支持发育的能力比体内成熟的差,HTF培养液更适合小鼠卵母细胞人工活化后的进一步发育.     

卵巢运输条件对牦牛卵母细胞质量与胚胎体外发育的影响

卵巢的运输条件是影响卵母细胞的质量与胚胎发育的主要因素之一.为了找到牦牛卵巢的最佳运输温度,将采集的新鲜牦牛卵巢分别置于15-20℃、25-30℃、35-40℃的生理盐水中,1-2 h送回实验室,比较不同运输温度下的可利用COCs回收率、卵母细胞成熟率、孤雌激活与体外受精胚胎的体外发育.结果表明35-40℃运输卵巢能显著提高牦牛可利用COCs回收率(72.0％),但25-30℃组卵母细胞成熟率与其它组差异显著(78.9％);25-30℃组的卵母细胞进行孤雌激活与体外受精后,8细胞和囊胚形成率显著高于其它组(P＜0.05).由此推测:25-30℃为牦牛卵巢的最佳运输温度,能显著提高卵母细胞质量与胚胎体外发育能力.     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长，体外成熟，体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟，单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用，将体外受精后发育至２－细胞的胚胎