植物反应器生产药用蛋白的研究进展

现代基因工程技术最初是建立在结构简单的微生物。尤其是以大肠杆菌为受体表达外源蛋白，用植物反应器生产药用蛋白的思路出于偶然。二十世纪八十年代．比利时PGS公司的科学家将一个神经肽(enkephalin，脑啡肽)编码基因转入烟草中表达．用意在于让瘾君子们不用抽烟，只需拿烟叶闻一闻或放在口中嚼一嚼即可过烟瘾，以此减少尼古丁对人体的危害及减少空气污染。     

重组包涵体蛋白质复性

基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E．coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E．coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。     

SlNPV多角体蛋白基因的序列分析

ＳｌＮＰＶ多角体蛋白基因的开放读码框为７５０ｂｐ,编码２４９个氨基酸的蛋白质,是目前所发现的最长的多角体蛋白基因．ＳｌＮＰＶ多角体蛋白Ｍｒ＝２９２３６,其氨基酸序列与其它核多角体病毒的多角体蛋白氨基酸序列有高度同源性．     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

人补体调节蛋白基因MCP和DAF的克隆及其在E. coli中的表达

人膜辅基蛋白MCP(membrane cofactor protein)和降解加速因子DAF(decay-accelerating factor)是免疫排斥反应中补体系统活性调节的重要蛋白．以PCR的方法分别从成人肝cDNA文库和胎儿骨髓cDNA文库中扩增得到MCP和DAF基因，克隆入载体pUC19，再以所构建质粒为模板，以PCR的方式在二基因间加入编码柔性连接肽的DNA序列，构建融合基因MCP-DAF，并克隆入pUCl9质粒．将MCP、DAF及MCP-DAF亚克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )或pET-32b( )，构建表达载体MCP-pET32a，DAF-pET32b及MCP-DAF-pET32a，分别导入E．coli BL21菌株中表达，得到预期分子质量大小的蛋白．     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器，大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码，在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白，转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白，它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用，构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比，Toc33基因的表达调控研究较少，该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此，在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上，采用单引物PCR方法进行染色体步移，克隆出Toc33基因的启动子，为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

酪氨酸酶的研究进展

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是一种含铜的氧化还原酶，它广泛存在于动植物和微生物中，与生物体合成色素直接相关．在人体中，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关．因此对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控，以及酪氨酸酶的抑制剂和激活剂的研究，引起国内外的广泛重视．目前，对酪氨酸酶活性中心及其催化功能的研究比较透彻，但对酪氨酸酶蛋白的立体结构尚不清楚．     

EDSV六邻体蛋白基因克隆与原核表达载体构建

应用降落PCR技术扩增出减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因并将其克隆至pMDT-18载体上,经酶切、PCR鉴定及测序结果表明插入的片段为目的基因,全长2．733kb,共编码910个氨基酸。切下该目的基因定向克隆至pET-28a质粒构建了六邻体蛋白基因原核表达载体pET28a-hexon,经各种酶切、PCR鉴定及进一步测序后证明六邻体蛋白基因片段所插入的位置、大小、核苷酸序列和阅读框架正确无误,从而为下一步的表达及进一步阐明EDSV六邻体蛋白基因结构与功能的关系和减蛋综合征基因工程苗的研究奠定了良好基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白基因疫苗的构建及在小鼠的免疫试验

从PRRSV野毒株细胞培养上清提取RNA，用RT-PCR的方法扩增出M蛋白基因片段（525bp），并将该基因克隆到pMD18-T载体，测序结果与PRRSV BJ-4等株同源性最接近．以pIRES-neo为载体，构建表达PRRSVM蛋白的基因疫苗，按100μg／只的DNA量免疫小鼠，二免后二周抗体水平显著高于同期免疫空载体pIRES～neo组，于免疫后14、28、42天后均能检测到较高的细胞免疫水平．这说明表达M蛋白的基因疫苗能够刺激机体产生免疫应答．     

用dystrophin cDNA1－7的三个亚探针检出四个新的TaqⅠ限制性片段长度多态

报道在ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内新发现四个ＴａｑⅠ限制性片段长度多态，用ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｃＤＮＡ１—２ａ检测到的ＴａｑⅠ等位片段是４．０ｋｂ（Ａ１）和３．３ｋｂ（Ａ２），用ＣＤＮＡ２ｂ—３检测到的ＴａｑⅠ等位片段是７．２ｋｂ（Ａ１）和６．８ｋｂ（Ａ２）。用ｃＤＮＡ５ｂ—７检测到两对新的ＴａｑⅠ等位片段，分别是１０．０ｋｂ（Ａ１）和８．４ｋｂ（Ａ２），以及２．５５ｋｂ（Ｃ１）和１．６ｋｂ（Ｃ２）片段。在４５个ＤＭＤ／ＢＭＤ家系的基因检测中，这四对新的等位片段，在部分家系的上下代传递中分别呈孟德尔遗传学分离。它们的实际观察杂合体频率依次是：０．２９，０．０７，０．０４和０．１８，预期杂合体频率是０．２０，０．０６，０．０２和０．２０。这些新的ＴａｑⅠ限制性片段长度多态，已在杜氏肌营养不良症家系的遗传连锁分析及致病基因携带者的诊断中，显示出较高的；临床应用价值。     

绿色荧光蛋白基因在大黄鱼体内的表达

以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以pIRESnco为载体质粒，制备含有报告基因的质粒，以肌肉注射的方式导入大黄鱼体内，每隔一周用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因在鱼体不同部位的表达情况。结果表明，绿色荧光蛋白基因可以大黄鱼体内得到表达，表达时间高达28d以上。绿色荧光蛋白基因不仅可以在肌肉注射部都组织细胞得到表达，而且在其它部位的肌肉、肝脏、肾脏和心脏等组织中也有表达，但表达水平低于肌肉注射部位组织。     

对虾白斑综合症病毒类锌指蛋白基因(wsv063、wsv069和wsv477)的表达和纯化

从对虾白斑综合症病毒基因组的预测开放阅读框中选取3个编码类锌指蛋白的基因训wsv063、wsv069和伽wsv477，将它们克隆到pET—GST表达载体，以E．coli BL21（DE3）为宿主菌，成功表达了GST融合的目的蛋白．表达的GST-WSV063和GST—WSV477在菌体里主要以包涵体形式存在，GST-WSV069在菌体里可溶性形式和包涵体形式几乎等量存在．采用glutathione sepharose4B或Ni-NTA agarose亲和层析对目的蛋白进行了纯化．以上3种病毒蛋白的表达和纯化为进一步研究它们的功能奠定了基础．     

双杂交系统筛选与AID相互作用蛋白的初步研究

AID(APP intracellular domain)是由淀粉样前体蛋白APP经γ-分泌酶切割产生的胞内端，它可能参与细胞凋亡．基因转录等活动．并对阿尔茨海默氏症的形成有一定影响．为进一步研究AID的功能．在本实验中．我们用AID为诱饵蛋白．运用酵母双杂交系统筛选与其结合的蛋白，得到其中两个阳性克隆．一个为RPS21．另一个为FLJ20551．接着又在酵母体系用β-半乳糖苷酶报告基因验证了它们的相互作用．并在哺乳动物细胞中用免疫共沉淀的方法再次验证了它们相互作用的特异性．这些结果表明RPS21和FLJ20551可能通过与AID相互作用而影响阿尔茨海默氏症的形成。     

植物钾离子转运相关蛋白及基因研究进展

本文概述了植物体内与K^ 转运相关的蛋白及其基因，包括通道蛋白(channel protein)和转运体(transporter)及其基因,前者可分为：(1)内向整流K^ 通道(inward-rectifying K^ channel:Kin^ )，(2)外向整流K^ 通道(outward-rectifyjng K^ channel ：Kout^ )；相关基因有AKTI，ANTI，SORK，GORK等．后者分为低亲和K^ 吸收转运体及高亲和K^ 吸收转运体；相关基因有HAK，KUP等．     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

被子植物胚胎发育的分子遗传学研究

被子植物的胚胎发育有许多自身特点，它可分为形态发生，种子后熟两个阶段，前不仅产生了特定的组织器官或其原基，而且形成了根分生组织与茎端分生组织这两个主体模式元件，更重要的是决定了植物个体发育的程序与整体结构模式，体胚发生与合子胚发育经历相似的过程，体胚发生技术被广泛地用作检查合子胚发充早期子生物学事件的一种实验系统，但由于体胚发生与合子胚发育的基因表达也存在差异，对采用体胚发生技术研究合子胚发育机理的恰当性众说不一。除此之外，较有希望的研究方法还有遗传解剖法，人们已分离了大量与植物胚胎发育胶 有关的单基因突变体，对其研究的目的在于克隆与发育相关的那些基因，并进一步对之进行分析与鉴定以理解胚胎发育的分子机理，由于难以得珐足够量的材料用于分析，已分离到的大多数基因是胚发育较晚期特异性表达的基因，如种子储藏蛋白和LEA蛋白的基因，对它们的研究揭示了胚发育中基因表达调控的一些机理，如今已克隆到一些胚发育早期的基因，如与顶基轴向或辐射径向模式形成有关的基因，与细胞伸长，分裂，分化相关的基因等，本对被子植物中的胚胎发育及其研究进行了综合性阐述。     

纤细眼虫(Euglena gracilis)核纤层蛋白基因的初步研究

目的：探讨在纤细眼虫(Euglena gracilis)中是否存在核纤层蛋白(lamin)基因，为核纤层蛋白基因的起源与进化研究提供线索．方法：以较为低等生物的核纤层蛋白基因cDNA序列为参考，设计引物P0010和P0012，以纤细眼虫总DNA为模板进行PCR，PCR产物回收、测序．由于不能获取完整序列，所以据测序结果又设计了P0013和P0014两条中间引物，组成P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR，回收产物测序．结果：P0010／P0012、P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR分别获得775、400和395bp的特异性PCR产物，对这3种产物分别测序，最终获得了P0010和P0012之间的全序列，共775bp．结论：在纤细眼虫中存在着核纤层蛋白基因．     

P16基因及其表达在非小细胞肺癌中的研究进展

目的：使我们对P^16基因及其表达在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的早期诊断及治疗从分子水平上有进一步的认识。方法：就P^16基因在NSCLC人中的近期研究进展作一综述。结果：P^16（也称多肿瘤的抑制基因，MTS1和CDKN2)，它是一种抑癌基因。原发性NSCLC组织均可出现P^16／P^15基因纯合性丢失。肺鳞癌组织P^16基因的甲基化明显高于其它组织类型。在NSC比中病期愈晚P^16蛋白缺失越明显。被检病人痰及血中的P^16基因异常，有助于NSCLC的早期诊断。P^16和P^53基因联合共转染能显增强对NSCLC细胞增殖的抑制。结论：P^16基因及其表达蛋白与NSCLC的发生、发展、转移密切相关，应用于NSCLC的早期诊断及治疗。     

植物的铁营养与Nramp基因

植物的铁营养与Nramp基因家族密切相关，本文论述了植物Nramp基因的克隆，Nramp蛋白的结构与功能，以及Nramp蛋白在细胞的定位，并对今后的研究进行了展望．     

HIF-1调控小鼠bace1基因的转录表达

阿尔茨海默症的一个关键致病原因是大脑中淀粉样蛋白（A13）的过度产生或堆积．Aβ是由其前体蛋白APP经β-和γ-分泌酶依次水解而生成的，但对于这些分泌酶基因表达的转录调控的了解还很少．由于大脑发生缺氧／缺血会造成Aβ的产量增加，而缺氧时所激活的转录因子HIF-1（Hypoxia-Inducible Factor 1）会调控下游多种基因的表达，我们对HIF-1是否参与调控β-分泌酶的表达进行了研究．对小鼠β-分泌酶基因bace1的调控序列进行分析，发现其中含有一个缺氧应答元件（Hypoxia-Responsive Element，HRE）．我们的数据显示，HRE突变片段启动报告基因荧光素酶表达的活性比正常序列片段的启动活性明显降低．电泳迁移率的变动分析（EMSA）实验进一步证实，HIF-1可以与小鼠bace1中HRE元件相互作用．当在哺乳动物细胞中过度表达HIF-1时，BACE1的mRNA水平和蛋白质水平均有明显的增高．这些结果表明小鼠bace1基因的表达受转录因子HIF-1的调控．鉴于目前阿尔茨海默症研究领域都把抑制BACE1作为首选治疗靶位，HIF-1因而有可能成为治疗AD的一种药物靶点．