含抗HIV广谱中和抗体2F5、4E10靶基因载体的构建及鉴定

目的:构建含HIV gp120,gp41序列中广谱中和抗体2F5,4E10作用靶基因的载体并进行鉴定,为后期重组载体表达产物诱导产生中和抗体及抗HIV亚单位疫苗的研究奠定基础.方法:根据NCBI中HIV gp120,gp41基因序列中可与2F5、4E10结合的区域设计引物并进行PCR反应,将PCR得到的目的片段插入到载体pET28a中,对重组载体进行PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序.结果:PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序结果证实重组载体构建成功.结论:成功构建了含HIV gp120,gp41序列中广谱中和抗体2F5,4E10作用靶基因的载体.     

2个棒状杆菌质粒pXZ10142和pXZ10145.1及其转座子TN45的特征分析

对1株棒状杆菌1014中分离到的2个质粒pXZ10145．1和pXZ10142进行了相互关系分析．序列分析显示pXZ10142源自pXZ10145．1．pXZ10145．1包括6个开放读码框(open reading frame,ORF),其中ORF1编码247个氨基酸,经缺失分析是复制酶．在pXZ10145．1上发现1个转座子TN45,转座子上有CMR基因和TNP基因．一对颠倒重复序列IR1a和IR1b位于pXZ10145．1和pXZ10142的交互处,两边是顺向重复序列ATCTAG．     

pEGFP-Egr-1表达质粒构建及其表达抑制HepG2细胞增殖

将RT-PCR扩增的Egr-1基因连接到pMD-18载体上并测序鉴定,经测序正确的Egr-1基因亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上构建成重组质粒pEGFP-Egr-1.重组质粒pEGFP-Egr-1转染HepG2细胞后,运用荧光显微镜及荧光定量PCR技术分析其在HepG2细胞中的表达情况,并进一步运用WST-1法分析其表达对HepG2细胞增殖的影响.结果显示,重组质粒pEGFP-Egr-1构建正确,转染后在荧光显微镜下观察可见HepG2细胞发出绿色荧光信号,荧光定量PCR分析发现转染后HepG2细胞Egr-1基因mRNA水平明显升高.WST-1结果表明,与对照组相比,转染pEGFP-Egr-1质粒的HepG2细胞,其增殖速率明显下降.上述结果表明,pEGFP-Egr-1重组质粒构建成功,外来过表达Egr-1基因能够抑制HepG2细胞增殖.     

重组质粒p434crohis的构建与表达

根据噬菌体４３４ｃｒｏ的基因序列,合成了一对在Ｃｒｏ的Ｃ－末端含有６个Ｈｉｓ密码子的寡核苷酸（６９ｂｐ）,并在其两端设计了ＰｓｔＩ和ＫａｓＩ两个酶切位点。经粘合、退火后将双股寡核苷酸链分别插入ｐ４３４ｃｒｏ（３．３５ｋｂ）质粒的４３８位（ＰｓｔＩ切点）和６３８位（ＫａｓＩ切点）,构建成含４３４ｃｒｏｈｉｓ基因的重组质粒。其表达产物为Ｃ端含有６个Ｈｉｓ的阻遏蛋白４３４ｃｒｏｈｉｓ。经功能测定表明融合蛋白４３４ｃｒｏｈｉｓ仍具有调节ＤＮＡ转录功能,并用金属亲和层析鉴定了表达产物     

水稻同源重组型质粒载体的构建

根据同源重组机制,以水稻17S-5.8SrDNA 2.5 kb 同源片段和含有MT基因、Km r 基因的外源DNA片段构建了质粒载体pURKMT,并用电激法转化水稻愈伤组织,经Km 筛选,获得了对Km 抗性明显高于基础抗性的愈伤组织.经DNA斑点杂交检测,证实外源基因已整合到水稻基因组DNA中.     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.     

一种快捷可靠的大肠杆菌重组质粒筛选方法

针对如何大规模地筛选大肠杆菌重组子,将质粒快检和菌落PCR两种方法巧妙地融合,建立一种新的高效快捷的重组质粒筛选方法.该方法不需接种抽取质粒,在转化子长出当天即可筛选到重组质粒.大规模基因克隆表明该方法能够快速、准确地筛选出阳性克隆.