海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.     

偶氮氯膦Ⅲ比色法测定褐藻胶中微量钙

作者研究了以偶氮氟膦Ⅲ比色测定褐藻胶中微量钙的方法。在溶液pH为3.0～3.5时,钙与偶氮氯膦Ⅲ形成绿蓝色络合物,络合物最大吸收波长在620nm处,摩尔吸光系数为9.2×10~3。络合物组成为1:1,钙的回收率为98.0～106.0％,可用EDTA或NH_4F、8—羟基喹啉掩蔽铁、铝、锌、镁。本方法可测出褐藻胶中1％以下的钙。     

高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化

以海藻酸钠为唯一碳源,从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#,经形态学观察和16S r RNA鉴定,确定为类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans。采用正交试验方法,以p H、温度、Na Cl浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素,对该菌株的产酶条件进行优化,得到53#菌的最佳产酶条件:p H=8,25℃,Na Cl浓度15 g/L,海藻酸钠初始浓度15 g/L。在最佳产酶条件下,褐藻胶裂解酶最大酶活可达390.53±17.32U/m L。筛选得到的类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点,能够实现褐藻胶的高效糖化,在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值。     

重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析

为探索假交替单胞菌（Pseudomonas syringae）重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的动态过程变化,采用DNS法和苯酚－硫酸法分别测定体系还原糖和总糖,根据二者比例,得出酶解产物随时间变化的平均聚合度,从而研究各因素对褐藻胶降解过程的影响,确定褐藻胶酶解工艺条件。结果表明,重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的适宜工艺条件为:水解温度25 ℃,pH 7.5,初始底物质量浓度7 g/L,加酶量0.48 U,静置条件下酶解反应210 min。在此工艺条件下,产生的还原糖的质量浓度达0.878 g/L,平均聚合度为3。酶解终产物的质谱鉴定结果显示为单糖、二糖和四糖。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

褐藻及褐藻酸的研究现状和进展

褐藻及从褐藻中分离出的一种重要化合物——褐藻酸具有广泛的应用价值。对褐藻的生物性状、地域分布及其产品褐藻酸的种类、地域分布、化学结构、理化性质、生产工艺及应用作一全面的阐述。     

假单胞菌褐藻胶裂合酶活性片段的基因克隆及重组表达条件的优化

为分析假单胞菌（Pseudomonas）膜周质中褐藻胶裂合酶（alginate lyase,AlgL）的最小活性单元,进行了活性片段的初步研究.用简并引物克隆MY01菌株中AlgL基因的片段,用特异引物扩增目的序列并克隆入pBAD gⅢ/A载体,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆.进行L-阿拉伯糖诱导表达条件的优化,超声破碎重组菌体并分离水溶性组分作为粗酶,以褐藻酸钠为底物进行酶解反应,在235 nm测定产物的吸收值.结果该基因片段300 bp大小,GenBank收录号为AY736133,所编码的氨基酸序列中含有基序“NNHSYW”,且在系统发育树中与假单胞菌的AlgL聚类.在优化条件下获得粗酶,酶解反应产物在235 nm有显著吸收,表明重组融合蛋白具有褐藻胶裂合酶活性.褐藻胶裂合酶的研究较多,但其活性片段的重组表达研究少见报导.     

假单胞交替菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为初筛培养基的唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的假单胞交替菌BYS-2。对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方(w/v)为：褐藻酸钠0.1%,葡萄糖0.05%,酵母膏1%,黄豆饼粉0.3%,(NH4)2HPO4 0.3%,初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为：接种量2%(v/v),装液量50mL/250mL,发酵温度20℃,摇床转速200 r/min,在此条件下发酵24h酶活力可达5.29U/mL,比优化前(1.57 U/mL)提高2.37倍。     

钙离子对褐藻胶胶膜成形及胃溶性的影响

褐藻酸是从褐藻类植物(如海带、马尾藻等)中提取的，主以褐藻酸形式存在的物质，其用途广泛。本文仅就其应用医药工业制胶囊时添加钙离子对其成膜及胃溶性的影响进行初步的探讨。、以褐藻酸和褐藻酸钠组成的胶液在pH>4．5时，胶膜由于易淌胶而难以成膜；当pH<4．5时形成的胶膜组织的均匀性及透明度等感官指标低，达不到产品的要求。通过人为地添加少量的钙离子则可使胶膜组织达到较理想的指标。并且，经人工胃液、X光人体胃液追踪透视及装药后临床服用等试验，其胶膜均能达到在限定时间内崩解的要求。