新一代阳离子聚合物转染试剂(梭华-Sofast) 转染效果研究

采用DNA延滞实验研究新一代阳离子聚合物梭华 Sofast转染试剂与DNA的结合能力,以不同报告基因(绿色荧光蛋白基因、β 半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因),分析比较梭华 Sofast与阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳离子聚合物JetPEI、Superfect转染HEK293细胞转染效率和细胞毒性,研究梭华 Sofast转染试剂转染效率.实验结果表明梭华 Sofast与DNA有很强的结合能力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,梭华 Sofast转染率最高,约60%左右,而且在单个细胞中表达的GFP量多;转染细胞荧光素酶活性检测结果表明,当梭华 Sofast与DNA质量比为16时,转染率最高,高于109RLU/mg蛋白,分别是JetPEI,Superfect和Lipofectamine2000转染细胞最高活性的1.6,2.3和5倍;梭华 Sofast转染β 半乳糖苷酶的染色结果显示95%以上的阳性细胞转染率;比较基因转染效率最高时的细胞毒性,在最佳转染剂量时,几种试剂的细胞存活率均在83%以上,而梭华 Sofast为94.23%.在目前市场上销售的转染试剂对HUV EC细胞的转染效果均不理想情况下,梭华 Sofast仍具一定的转染效率,阳性细胞约占20%.研究结果表明梭华 Sofast是一种高转染效率,低细胞毒性的转染试剂.     

增强型绿色荧光蛋白表达对鼠C6细胞生物学特征影响的研究

脂质体包裹质粒pEGFP-N1转染C6细胞,经G418筛选,得到稳定表达绿色荧光的C6-EGFP细胞.细胞计数,MTT,流式细胞术分别测定C6细胞在转染绿色荧光蛋白后增殖性,细胞活力以及细胞周期等生物学特性.C6细胞在转染了绿色荧光蛋白基因后细胞增殖性降低,细胞活力降低,细胞周期也发生了一些改变.     

一种新颖的阳离子非病毒基因载体 Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH 的性能研究

研究了新型阳离子聚合物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的性能，重点考察其粒度，基因转染效率与细胞毒性，探讨了其作为基因载体的可能性.通过动态光散射仪（DSL）、透射电镜（TEM）观察了Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH与DNA自组装形成的颗粒形态及粒径，Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH可复合DNA形成粒径160～210 nm的纳米复合物，适合进入细胞.使用MTT比色法分析Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH的毒性并与PEI，PEI-g-PEG-OH比较.选用增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 转染Hela细胞，应用流式细胞术检测转染效率.新型阳离子多聚物Chitosan-g-PEI-g-PEG-OH在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性，有望成为基因转移的有效载体.     

TGFβ1 shRNA对293细胞合成TGFβ1的干扰作用

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对293细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗方法提供技术基础和依据.方法:针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1 shRNA和TCFβ1基因的绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空质粒组为对照,通过脂质体包裹分别转染293细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TGFβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后293细胞TGFβ1mRNA表达量,转染后24、48和72 h TCFβ1shRNA质粒组TCFβ1mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.2%、97.1%和67.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染293细胞后24、48和72 h TGFβ1shRNA均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

脐血间充质干细胞在大鼠损伤肝脏迁徙途径的实验

目的:建立慢病毒载体转染增强型绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞的实验体系,观察绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠模型肝脏局部的迁徙途径.方法:采集新鲜人脐血,梯度离心及低血清培养基体外分离、培养人脐血间充质干细胞,以慢病毒为载体转染绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞.CCl4橄榄油溶液腹腔注射建立急性肝坏死大鼠模型,将2.0～5.0×106绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给模型鼠,24、48、72 h、1周、2周和4周分别处死模型鼠,冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞在肝脏局部的迁徙途径.结果:转染细胞荧光显微镜下呈现均一绿色荧光影像.细胞移植24 h内可见荧光信号由进针孔迁徙至汇管区,移植治疗48 h时移植细胞定居于汇管区,48 h后荧光信号向坏死病灶区域迁徙,1周后在肝脏坏死局部区域可见稳定的荧光信号.结论:本实验构建的绿色荧光蛋白转染人脐血间充质干细胞示踪体系稳定表达绿色荧光蛋白.经动物实验证明人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给肝坏死大鼠模型后在肝脏局部经历了"进针孔至汇管区","汇管区至病灶区"的二次迁徙模式.     

腺病毒介导的mIL-12基因转染H22细胞及对其生长的影响

目的:研究重组小鼠白介素-12腺病毒(AdvmIL-12)和携带增强型荧光蛋白腺病毒(Adv-EGFP)在小鼠肝癌细胞H22中的转染及对其生长的影响。方法:将mIL-12基因p35、p40的cDNA分别插入5型腺病毒的E1和E3区构建成AdvmIL-12,分离纯化后进行鉴定、病毒滴度检测;同法构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组腺病毒(Adv-EGFP)。在不同的感染复数(MOI)、感染时间(TOI)条件下用Adv-EGFP转染H22细胞,观察Adv-EGFP的转染率。用AdvmIL-12、Adv-EGFP分别转染H22细胞,ELISA法检测上清液中mIL-12的含量。改良MTT法检测AdvmIL-12、Adv-EGFP在体外对H22细胞生长的影响。结果:得到AdvmIL-12和Adv-EGFP,每毫升空斑形成单位(PFU/mL)分别为1×108、1×109。TOI为1、2、4、24h时,转染效率分别为87 67%、96 38%、96 43%和96 32%;MOI为0、50、100、200、500时,转染效率分别为0、89 29%、96 41%、96 72%和98 37%。106个AdvmIL-12/H22细胞上清液中mIL-12(48h)为(89 71±22 05)ng。AdvmIL-12和Adv-EGFP对H22细胞生长无抑制。结论:本实验成功构建了AdvmIL-12和Adv-EGFP,它们在体外能够转染H22细胞,并能表达mIL-12和EGFP,但不能抑制H22细胞的生长。感染复数为100、感染时间为2h是重组腺病毒转染H22细胞的最适条件。     

pEGFP-Egr-1表达质粒构建及其表达抑制HepG2细胞增殖

将RT-PCR扩增的Egr-1基因连接到pMD-18载体上并测序鉴定,经测序正确的Egr-1基因亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上构建成重组质粒pEGFP-Egr-1.重组质粒pEGFP-Egr-1转染HepG2细胞后,运用荧光显微镜及荧光定量PCR技术分析其在HepG2细胞中的表达情况,并进一步运用WST-1法分析其表达对HepG2细胞增殖的影响.结果显示,重组质粒pEGFP-Egr-1构建正确,转染后在荧光显微镜下观察可见HepG2细胞发出绿色荧光信号,荧光定量PCR分析发现转染后HepG2细胞Egr-1基因mRNA水平明显升高.WST-1结果表明,与对照组相比,转染pEGFP-Egr-1质粒的HepG2细胞,其增殖速率明显下降.上述结果表明,pEGFP-Egr-1重组质粒构建成功,外来过表达Egr-1基因能够抑制HepG2细胞增殖.     

c-fos启动子与GFP重组质粒的构建及在Pc12细胞中的表达

目的：构建c—fos启动子与GFP的重组质粒载体,并使其在体外培养哺乳动物pcl2细胞中表达．方法：Xba I、Hind Ⅲ双酶切含c—fos启动子的HF443质粒,纯化后与同样双酶切的绿色荧光蛋白基因连接;利用Lipofect AMINE 2000将重组质粒转染体外培养哺乳动物pcl2细胞．结果：加入Na^ 通道激活剂乌头碱后,转染后的pcl2细胞可发出较强的绿色荧光．结论：c—fos启动子与GFP重组质粒构建成功,并可用于哺乳动物活细胞c—fos基因的检测．     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA，利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因，将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中，构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene，EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene，ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR，并将其转染Hela细胞系，用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞，然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达，用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体；在转基因细胞中，PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带，蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符；荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中，EGFP和ALR同时存在并表达，绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达，从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

辽阳职业技术学院高尔夫学院发展现状研究

采用问卷调查法、文献资料法、数理统计法对辽阳职业技术学院二级分院高尔夫学院成立三年来招生、专业设置、教师队伍与实习实训等现状进行深入调查与分析,结果表明:在招生方面,高尔夫学院目前还未能得到家长的充分认可,招生人数不多;专业设置单一,实践教学及社会服务能力薄弱;实习实训条件较好,但仍需进一步完善;教师队伍建设相对滞后.针对上述情况,给出促进高尔夫学院稳步发展的建议.     

关于一维非自治时滞系统点态退化的例子

给出了一维非自治时滞系统点态退化的几个例子。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

鸡法氏囊病及其防治

报告鸡法氏囊病的流行状况，主要症状，剖检情况及诊断，提出了综合性防治措施。     

圈幂补图的树宽

基于“前沿分支”的观点研究了圈幂补图的树宽，首先确定了它的树宽下界，又给出了达到此下界的标号，从而得到了它的树宽表达式。     

发动机转动惯量的实验测定

发动机转动惯量是发动机系统动态模型的一个重要参数,一般需要通过试验测取发动机转速衰减曲线,再由曲线拟合而得。在文中提出一种试验曲线的全程拟合法,比以往的标定转速点拟合法可以取得更高的精度。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

接受美学的期待之路——读者接受与文学的创新

文学发展的动力之一在于创新。在接受美学诞生之前,学者们往往从作家的角度讨论文学创新问题。本文用接受美学的理论探讨文学创新的问题。笔者将文学创新的标准与读者接受相结合,就创新的三个方式与期待视野的方法论进行了初步的探讨。最后得出的结论是:读者期待视野的提高是作家作品创新的主要依据,作家在文学创作中应该充分考虑读者的接受才能做到创新。     

膨胀土路基沉降的可靠度分析

针对膨胀土路基沉降的不稳定性和随机性等特点，以膨胀土的膨胀率、线收缩系数、初始含水量、工后沉降期始末的孔隙比变化量和固结度变化量、工后沉降期末的含水量等为基本变量，提出了膨胀土路基沉降的可靠度分析方法和可靠度指标的迭代计算步骤，并就具体工程实例进行了膨胀土路基沉降可靠度计算．结果表明按强度和稳定性设计原则设计的路基的工后沉降超过容许沉降的失效概率较大。