抗促黄体激素单克隆抗体的研制：Ⅱ单克隆抗体的纯化及特性鉴定

在建立六株稳定分泌抗促黄体激素(LH)单克隆抗体的杂交瘤细胞株后,用羟基磷灰石(HAP)吸附层折技术从小鼠特异腹水中一步纯化抗LH单克隆抗体,抗体纯度可达85％—90％,在纯化抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上基本显示IgG一条带,每ml腹水回收IgG量为3.6mg,并保留大部分抗体活性。特性鉴定结果表明,在六种抗体LH单克隆抗体中,AL-02和AL-06两种抗体与促卵泡激素(FSH)不产生交叉反应,是抗LH-β亚单位上的抗原决定簇的:其它四种抗体与FSH产生完全的交叉反应,是抗LH-α亚单位上抗原决定簇的。用測定抗体与抗原相对结合力的方法估算了四种抗LH单克隆抗体的相对亲和力,结果是AL-01抗体相对亲和力提高,其后依次是AL-03,AL-04和AL-02抗体。     

抗猪促卵泡激素小鼠源单克隆抗体的研究

用猪促卵泡激素(PESH)作为抗原免疫BALB/C小鼠。通过将免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠骨髓瘤细胞(SP2/O—Ag14)进行融合,建立了九株能稳定分泌抗PFSH单克隆抗体的杂交瘤细胞。其中三株杂交瘤细胞分泌的抗体被证实是对PFSH特异结合的,它们和另一种非常相近的垂体激素——猪促黄体激素(PLH)不结合。用有限稀释法对全部九株杂交瘤进行了三次亚克隆。有几种单克隆抗体被羟基磷灰石柱层析一步法从小鼠腹水所纯化。以聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测经纯化单克隆抗体制品的纯度。     

抗伊氏锥虫单克隆抗体的研究——一、分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为了对伊氏锥虫病的免疫诊断提供有价值的单克隆抗体,笔者通过了3次SP2/0骨髓瘤细胞与伊氏锥虫抗原免疫的BALB/c小鼠脾细胞间的融合试验和多次筛选以及克隆化,建立起7株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中ⅡG_6杂交瘤作了进一步的检定分析,用ⅡG_6上清液对T.e.抗原进行ELISA试验,显示出高度的特异性,与血吸虫、弓形虫抗原均未出现交叉反应。ELISA测试ⅡG_6细胞株培养上清效价为1:5.1×10~3,而杂交瘤细胞接种BALB/c小鼠诱生腹水抗体的效价为1:1.6×10~7。该株单克隆抗体免疫球蛋白的类型鉴定属IgG_1亚类。该株细胞已在体外培养下,稳定地分泌特异性抗体至少达6个月之久,同时在液氮冻存近8个月之后仍能保持分泌抗体的能力。     

基因工程人表皮生长因子（rhEGF）单克隆抗体的制备与初步鉴定

以基因工程人表皮生长因子(rhEGF)为抗原,免疫BALB/c小鼠,将免疫的小鼠脾细胞与小鼠Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行融合,经多次筛选和再克隆化,获得3株能稳定分泌抗rhEGF单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株.对该3株杂交瘤细胞小鼠腹水进行了抗体效价测定,结果显示在1×10-6～2×10-7之间.对上述3种杂交瘤单抗(分别命名为:AE-2A4,AE-2G5和AE-3E11)进行了特异性、抗原决定簇及相对亲和力测定.结果表明,它们都具有抗rhEGF高特异性;并分别抗两个不同抗原决定簇;相对亲和力大小次序为:AE-3E11>AE-2A4>AE-2G5.Ig亚类鉴定结果显示:AE-2A4,AE-3E11同为IgG1亚类,而AE-2G5为IgG2b亚类.确定AE-2A4单克隆抗体可用于制备高纯rhEGF.     

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.     

环氧合酶-2单克隆抗体的制备和初步应用

以合成肽COX-2-KLH为完全抗原免疫BALB/c 小鼠,通过脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合的杂交瘤技术,筛选获得4株(1E10、3D6、5B11、6G4)稳定分泌抗COX-2单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株.采用ELISA的方法鉴定McAb效价、亚型及特异性.各株McAb均属IgG1 亚型,其中1E10腹水纯化后MCAb效价在1∶107以上,SDS-PAGE电泳为单一条带,与同源异构体蛋白不发生交叉反应.获得的McAb被成功应用于COX-2生物学研究中的免疫组织化学(IHC)和Western Blot试验中.本研究获得的单抗具有特异、高效的特点,为COX-2生物学相关研究提供理论依据.     

乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测。方法提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测。结果获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类。G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上。结论成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测。     

抗爪蟾角蛋白单克隆抗体的研究

本实验以非洲爪蟾(Xenopus laevis)成体皮肤角蛋白免疫的BALB/c鼠脾细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下进行融合,经HAT选择培养、ELISA筛选、反复克隆化及冻存复苏,获得四株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。对其中一株杂交瘤细胞KD_(10)及其分泌的抗体进行了较全面的研究。     

抗传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将传染性支气管炎病毒M41毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增M基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-M,导入大肠杆菌Transetta (DE3)内诱导表达。将纯化后的重组M蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备能稳定分泌抗M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗M蛋白的单克隆抗体,用辛酸/硫酸铵方法纯化腹水,并对纯化的单克隆抗体进行了鉴定。     

小麦GLB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以小麦主要过敏原Glb-1蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用细胞融合和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞株,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水并用蛋白A亲和层析法纯化抗体后检测。采用间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的IgG亚型;通过间接ELISA鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心ELISA法检测单抗的抗原表位特异性。结果表明:共获得4株可稳定分泌小鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白的单克隆抗体,分别命名为1C4、4H5、1A9、4F5,经检测其Ig亚型均为IgG1,且4株单抗效价均在10-9以上。ELISA结果分析表明该4株单抗均能特异性识别小麦主要过敏原Glb-1蛋白且和其他常见食物无交叉反应性。将4株单抗两两配对进行ELISA实验,结果发现1C4与4H5可能有不同的抗原表位,以此建立的双抗夹心ELISA系统可以检测小麦Glb1-G3蛋白。实验成功制备了鼠抗小麦主要过敏原Glb-1蛋白抗原的单克隆抗体,并且建立了双单抗夹心ELISA检测系统,为小麦主要过敏原蛋白的检测奠定了基础。     

抗迟缓爱德华氏菌单克隆抗体制备及初步鉴定

用灭活迟缓爱德华氏菌菌株AL60306NA1免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗迟缓爱德华氏菌的McAb,获得3株可持续分泌抗迟缓爱德华氏菌McAb的杂交瘤细胞株3A7、4F11和4C9;腹水效价分别达到1.0×10-6、1.0×10-6和1.0×10-5;细胞亚型分别为IgG1、IgG2b、IgM.交叉反应结果...     

NOK/STYK1单克隆抗体的制备及应用

根据NOK/STYK1(Novel Oncogene with Kinase Domain或Serine/Threonine and Tyrosine Receptor Protein Kinase)的结构特点设计并合成抗原,免疫Balb/C小鼠后,取免疫反应最好的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.应用有限稀释法筛选得到能稳定分泌抗NOK/STYK1的单克隆杂交瘤细胞株7G9.该细胞株经过扩大培养后,通过小鼠腹水制备纯化出NOK/STYK1的单克隆抗体.Western blotting和ELISA检测结果显示,纯化出的单克隆抗体能够特异性识别NOK/STYK1,且效价较高.通过免疫荧光标记和免疫组化分析显示,该单克隆抗体能够有效检测多种肿瘤细胞内及恶性肿瘤组织样本中高表达的NOK/STYK1.     

抗人体乳腺癌单克隆抗体6C_6杂交瘤细胞株的建立

用乳腺癌患者的原发瘤组织制备的细胞膜抗原免疫BALB/C小鼠,取致敏脾脏细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。融合率为42％,经克隆化培养后得到一株分泌抗人体乳腺癌单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为6C_6。其分泌的抗体和乳腺癌细胞系MCF-7呈阳性反应,与其它5种人癌细胞系,1种人正常细胞系及4种鼠类肿瘤细胞系呈阴性反应。免疫组织化学实验表明:6C_6单克隆抗体(简称6C_6McAb)与乳腺癌的反应多呈阳性(30/36),与7例正常乳腺均呈阴性反应。6C_6McAb类别为IgC_1。其抗体经ZetaPrep大容量离子交换圆盘纯化,对乳腺癌原发瘤组织仍具有较高的活性。     

抗传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增N基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-N.将测序正确的重组质粒转化入E.coli Transetta(DE3)感受态,对重组蛋白进行诱导表达并纯化,切除GST标签.采用纯化的N蛋白制备抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合.利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆筛选出13株单抗,其中8株能与IBV结合.通过体内诱生腹水的方法对1A12C5细胞株进行大量制备,辛酸/硫酸铵方法对腹水进行纯化并鉴定.     

抗沙门氏菌O4抗原单克隆抗体的研制及鉴定

制备抗沙门氏菌O4抗原单克隆抗体并鉴定其特性.用加热灭活的乙型副伤寒沙门氏菌免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合方法建立分泌抗体的杂交瘤细胞株.用包被沙门氏菌全菌和纯化的乙型副伤寒沙门氏菌LPS的间接ELISA法筛选杂交瘤细胞和鉴定抗体.其中3株杂交瘤细胞分泌的抗体初步判断为针对O4抗原的抗体,分别命名为1E12、2D5和4C2,这3株抗体与肠道正常细菌及常见的致病性细菌无交叉反应;单克隆抗体的免疫球蛋白类型分别为IgG1κ和IgMκ.获得的单克隆抗体具有较高的特异性,有可能用于B群沙门氏菌免疫学检测方法的建立.     

人凝血因子X单克隆抗体的研制及鉴定

目的　用于提取高纯度凝血因子X(FX)和制备缺乏FX血浆 ,以及建立FX抗原的ELISA检测方法等 .方法　用较高纯度的FX免疫Balb/C小鼠 ,经过 2次基础免疫 ,1次加强免疫 ,3d后取其脾细胞与骨髓瘤SP2 /0 Ag14细胞在PEG作用下进行细胞融合 ,经间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株 ,通过免疫印迹试验、交叉反应试验、相加试验和二价金属离子依赖性试验等 ,对单克隆抗体进行鉴定 .结果　经 3～ 4次克隆化后获得了 10株能稳定分泌FX单克隆抗体 (FXMcAb)的杂交瘤细胞株 ,Ig亚类均为IgG1型 ,小鼠腹水效价均在 10 6以上 ,FXMcAb只与FX抗原起特异性反应 ,FXMcAb与FX抗原的结合不同程度地依赖于二价金属离子Zn2 .结论　所筛选出的FXMcAb为高纯度FX的提取和缺乏FX血浆的制备以及FX抗原的ELISA检测方法的建立 ,提供了试剂准备 .     

抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定

【摘要】目的 制备抗人FXYD3单克隆抗体（McAb）并鉴定其生物学特性。方法 以固相合成法获得的FXYD3合成多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人FXYD3 McAb。用ELISA 、Western Blot、免疫组化技术对抗人FXYD3 McAb的亚型、效价、亲和力及特异性进行鉴定。结果 筛选出两段较好的优势抗原表位,分别为NDLEDKNSPFY和KFGQKSGHHPGETPPLITPGSA获得四株可稳定分泌抗人FXYD3 McAb的杂交瘤细胞株02A12C4、02F1E8、02E6B10与03A10E11,亚型鉴定重链均为IgG1,轻链为kappa链。间接ELISA法测定效价均在为1∶104以上。其中02F1E8效价为1∶105以上,亲和常数为3.11?08 L / mol。免疫组化分析显示了FXYD3均匀分布于肝癌细胞与人胰腺癌Bxpc-3细胞系细胞的胞膜上。结论 成功制备了四株抗人FXYD3 McAb,其中02F1E8纯度好、效价高及特异性强。为进一步研究FXYD3在肿瘤组织及细胞系中的表达及临床意义奠定了基础。     

抗鱼卵透明带单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤的建立及初步鉴定

详细介绍了抗鱼（花鲢Anstichthysnobilis）卵透明带单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤的制备及鉴定方法，用佛氏佐剂乳化热溶花鲢鱼卵透明带，然后免疫雌性BALB／C小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤Sp2／0融合产生杂交瘤，经3次再克隆后，用间接ELISA方法筛选出一株抗鱼卵透明带的单克隆抗体杂交瘤，经免疫双扩散试验测得该种单克隆抗体为IgG1，经过染色体检查知其染色体数目在86～108之间，为93.6±3.81，杂交瘤细胞染色体经检查发现有中间和亚中着丝点染色体，符合杂交细胞染色体特征。     

抗人绒毛膜促性腺激素（HCG）单克隆抗体的研制和特性分析

以HCG为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠Sp2/0—Ag14骨髓瘤细胞融合,经反复筛选和再克隆化,获得8株能稳定分泌抗HCG特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中6个高效价单抗进行了特异性和抗原决定簇检测,选出两个抗相距较远不同决定簇的单抗(2D_4,4F_4)作进一步特性分析。结果显示:免疫球蛋白亚类鉴定,2D_4为IgGl亚类,4F_4为IgG2a亚类;亲和力常数(K_(affi)),2D_4为5.41±0.94×10~(-10)mol/L,4F_4为1.37±0.33×10~(-9)mol/L。证实该两种单克隆抗体可用于研制有关临床诊断试剂盒。     

卡那霉素单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

采用EDC法制备卡那霉素(KAN)完全抗原、卡那霉素-牛血清白蛋白(KAN-BSA)、卡那霉素-鸡卵清蛋白(KAN-OVA).用KAN-BSA完全抗原免疫BALB/c小鼠,并通过杂交瘤技术制备能够稳定分泌抗KAN单克隆抗体的杂交瘤细胞(1E1).通过体内诱生腹水大量制备单克隆抗体,鉴定1E1单克隆抗体,其效价为8×10~5,亲和力为2. 8×10~9L/mol,半数抑制浓度(IC50)为1. 09 ng/mL,与妥布霉素(TOB)的交叉反应率为53. 4%,与其他氨基糖苷类化合物没有交叉反应性.利用该单克隆抗体,建立KAN间接竞争酶联免疫吸附试验(ciELISA).ciELISA检测KAN在牛奶中的回收率为64. 4%～89. 6%,最低检测限为1. 92 ng/mL.