TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究

 利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆（Roundup Ready^TM）的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup Ready^TM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r²: 0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。     

采用基因芯片技术筛查农作物转基因背景

采用基因芯片技术对转基因作物中常见的启动子、终止子和选择标记基因等多个外源基因进行检测，以建立一套快速、准确的转基因作物筛查鉴定技术．通过对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测，并由常规PCR技术进行验证，证实基因芯片的检测结果准确可靠，并提高了检测效率，因此，可用于农作物转基因背景的鉴定．     

2个多品系混杂转基因大豆样品检测初探

为进一步确认转基因大豆品系,对实验室留存的2个转基因阳性大豆样品,采用实时荧光定性PCR方法进行17种转基因大豆品系筛查检测.对同时检出2个以上转基因大豆品系阳性的样品,分别采用单粒多靶点和清洗后单粒多靶点筛查检测方法进行复合性状品系的确认.根据3次的检测结果推断,1号大豆样品可能是GTS40-3-2、MON87708、MON89788等3种转基因大豆品系的混合物;2号大豆样品可能是MON89788×MON87708复合品系和A2704-12等2种转基因大豆品系的混合物.复合性状转基因大豆MON87708×MON89788品系为中国未经批准进口的转基因大豆品系.鉴于目前缺乏完整的检测技术体系和技术标准,这种多品系混杂样品中掺杂未批准复合性状品系的行为非常具有隐蔽性和欺骗性,国内的农业安全监管部门和海关检疫部门都应该对此高度重视.     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

转基因产品的检测方法

基因工程技术的飞速发展使转基因生物正在向产业化发展,而有效管理转基因产品的前提是对产品进行转基因成分的准确检测,本文简要介绍了转基因产品的发展概况以及转基因产品的检测研究现状。gus基因可测定外源基因的表达部位,因而被认为是首选的报告基因;PCR扩增方法快速简便;Southern杂交特异性强,可以检测外源基因的整合情况,是当前鉴定转基因产品的权威方法;Western杂交结果与性状表现有直接关系。     

DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响

国内外非常重视转基因产品的检测工作,主要依赖于DNA的PCR方法进行检测,其检测结果可靠、稳定、灵敏度较高。尤其在转基因产品的定值实验中,荧光定量PCR的应用起到重要的作用,但是DNA的质量是保证荧光定量PCR定值准确的关键。实验以100%的克螟稻为材料,用CTAB法、商品化的Promega、Qiagen以及TIANGEN提取试剂盒,分别提取克螟稻基因组DNA,经过核酸蛋白分析仪初步测定浓度、纯度以及离子浓度后,分别以水稻内源基因PLD和克螟稻特异性转化体引物及探针实施荧光定量PCR实验,以100%克螟稻为盲样实施定值,来确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的DNA提取方法,最终确定Qiagen和TIANGEN提取试剂盒满足荧光定量PCR对100%的克螟稻标准物质定值实验的要求。     

GRP1.8融合4CL1基因调控杨树木质素生物合成

将形成层定位启动子GRP1.8与毛白杨的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因融合,叶盘法转化毛白杨741,southern杂交检测表明融合基因已经整合到转基因杨树的基因组中.通过实时定量PCR技术测定mRNA的表达量,GC-MS分析4CL底物香豆酸的含量和定量硫酸木质素含量,分析了4CL基因的过量表达对转基因杨树生理生长的影响.实验结果表明,整合了正义4CL1的转基因植株在茎中的酶活性比野生植株增加了30%,木质素含量增加了40%.     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

实时荧光PCR方法检测含麸质的谷类产品管家基因

采用实时荧光PCR方法鉴别含麸质的谷类成分,选择大麦Hordein管家基因、小麦Gliadin管家基因、黑麦Sec1管家基因和燕麦Avenin管家基因作为物种鉴定的特异性标记基因,设计适合于Taqman探针实时荧光PCR扩增的引物和探针,从而达到鉴别检测食品中含麸质的谷类大麦、小麦、黑麦、燕麦成分的目的.特异性实验结果表明,分别采用大麦、小麦、黑麦、燕麦的引物和探针进行实时PCR扩增时,经检测25种样品,只有相对应的阳性物种样品产生荧光信号,其余非该物种样品均不产生荧光信号,表现出了很高的物种鉴定特异性.以大麦为例的灵敏性实验结果表明,原料样品检测灵敏性可达到0.01%,加工后的食品则可达到0.05%,符合食品成分痕量检测要求.     

多重PCR法快速鉴定转基因小麦植株及后代

根据转基因植物中常用的报告基因uidA、选择基因bar的序列，设计合成两对不同的引物，建立了在转基因小麦材料分子确证中，应用一次PCR反应同时扩增检测两种或多种外源基因的多重PCR方法．通过对质粒pAHC25以及30个转基因小麦样品进行PCR扩增分析，比较多重PCR的检测结果与单基因的PCR扩增结果，发现两者结果完全一致．     

牛肉及其制品中肉类掺假的荧光PCR鉴别体系优化

根据可能用于牛肉及其制品掺假的肉类原料(猪肉、鸡肉和鸭肉),设计了4对引物和探针.经过测试其具有良好的特异性后,对影响各自聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的5个影响因素包括Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶活、dNTPs浓度、引物和探针浓度以及模板DNA用量等进行了优化,确定了最佳的PCR扩增体系.同时,根据优化后的结果,对特异性进行进一步的测试,并使用建立的优化荧光PCR鉴别体系对混合样品和市售样品进行检测,确定整体检出限为0.1%(质量分数),并证明该鉴别体系的实际应用价值.     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

"突触引物"实时荧光PCR检测端粒酶活性

为建立一种简便的端粒酶测定方法，首先采用高灵敏的核酸染料SYBR Gold染色代替放射自显影，建立了简便可靠的扩增产物显示方法，进而合成了端粒酶扩增产物的模拟产物，考察了突触引物检测的可行性和灵敏度。在此基础上，建立了检测端粒酶活性实时荧光PCR。由于突触引物可以有效的降低非特异性扩增，有效解决了端粒酶活性检测中的非特异产物干扰，为定量检测端粒酶活性打下了基础。     

双谱段成像探测系统的多线程设计与实现

提出一种应用DSP/BIOS^TM进行多任务调度的嵌入式控制系统, 该系统解决了双谱段电晕探测系统中的多传感器控制以及图像数据处理等任务的响应以及切换, 实现了多CCD的实时控制与数据处理. 基于DSP/BIOS的双谱段电晕探测嵌入式系统采用多线程技术, 实现了利用可见光和太阳日盲区紫外光联合对电晕的探测以及定位功能. 系统的可靠性和实时性均优于现有不含DSP/BIOS^TM的DSP控制系统, 其软件功能扩展后可用于诸如现场检测、 监视等多传感器控制的场合.     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

比浊法测定皂角多糖修饰物硫酸基的方法学考察

运用比浊法测定皂角多糖修饰物的硫酸基含量.采用分光光度法,最大吸收波长为360 nm,研究了该方法的稳定性、重现性、回收率、定量限.稳定性试验表明,同一样品在8～36 min内检测值比较稳定;重现性试验表明,24h重复检测RSD ＜2.4％;定量限试验表明,该方法可以检测到的最低浓度是1mg/30ml;回收率为102％,相对标准偏差不大于3％.该方法准确、快速、灵敏度较高、重现性好,适用于植物多糖硫酸基含量的测定.     

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.