桃树PpADC基因克隆及逆境胁迫表达分析

多胺广泛参与植物生长、发育等生理生化进程和植物逆境应答反应,精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶.为研究桃树ADC基因的结构和逆境胁迫转录表达情况,试验利用同源序列法克隆桃树PpADC基因,对基因序列、编码蛋白结构等进行生物信息学分析,应用qRT-PCR检测基因PpADC在不同逆境胁迫过程中的转录表达量.结果表明,桃树PpADC基因含有一个2 178 bp的开放阅读框,编码725个氨基酸,基因序列中不含有内含子结构;该基因编码蛋白与白梨精氨酸脱羧酶相似值高达90.14%,系统进化树分析表明PpADC基因与白梨、苹果和湖北海棠等蔷薇科果树ADC基因亲缘关系较近;低温、脱水、盐和乙烯处理能不同程度上调PpADC基因的转录表达水平,表明该基因在桃树应答逆境胁迫过程中发挥重要作用.     

何首乌中Ⅲ型PKS基因的克隆和表达

为利用基因工程技术调控何首乌的次生代谢途径,采用互补DNA末端快速扩增技术以及生物信息学方法,从传统中药材何首乌中克隆到一种Ⅲ型PKS基因FmPKS2(GenBank登录号:GQ984139),其互补DNA全长1498bp,编码392个氨基酸.生物信息学预测其蛋白相对分子质量为43160,等电点为5.85,亲水系数为-0.154,含有几个较强的疏水区域.系统进化树显示,FmPKS2与蓼科植物的查尔酮聚合酶聚类关系最近.该基因在何首乌不同组织中均有表达,其中在块根中表达量最高.     

拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

对拟南芥氰丙氨酸合酶(cyanoalanine synthase,CAS)基因进行了生物信息学分析,并构建了CAS合酶基因的超表达载体,以期为其后续功能研究奠定基础。生物信息学分析结果表明,编码拟南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因均含有10个外显子和9个内含子,定位于3号染色体,而CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子,定位于5号染色体;3个基因编码的蛋白氨基酸序列相似度较高,CYS-C1蛋白偏碱性且主要在线粒体中起作用,而CYS-D1和CYS-D2蛋白偏酸性,主要在细胞质中起作用。通过RT-PCR扩增了拟南芥CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因片段,并构建了超表达载体p BI121-35S-CYS-C1、p BI121-35S-CYS-D1和p BI121-35S-CYS-D2,经检测重组质粒已转化到农杆菌GV3101中。     

野苋菜凝集素基因的克隆及抗蚜性

通过PCR从苋科植物野苋菜Amaranthus viridis L.基因组DNA中扩增出野苋菜凝集素的核基因片段AVA。序列分析结果表明该基因为1831 bp,含有一个922 bp的内含子和两个分别为212 bp和697 bp的外显子。采用反向PCR技术获得了该基因的编码区克隆。分别构建含有内含子和不含内含子的AVA基因植物表达载体pBI121AVA-GUS和pBI121AVAc-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草。PCR、GUS检测结果均表明AVA基因不仅已整合到烟草基因组DNA中,而且初步表明转基因烟草有AVA蛋白表达。抗蚜实验表明含内含子和无内含子的AVA基因在转基因烟草中的抗蚜能力不同,转AVA和AVAc烟草对蚜虫的抑制率分别为60.81%和50.63%,有的植株高达97%。实验结果表明所克隆的AVA基因是具有抗蚜能力的苋菜凝集素基因家族中的新成员。     

红树林土壤微生物模块化聚酮合酶基因(簇)及其多样性研究

聚酮类化合物(Polyketide)是一类重要的具有药用价值的生物活性分子.通过宏基因组学技术获得了红树林土壤微生物中模块化聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因(簇),并对其多样性进行了研究.首先构建了该红树林土壤微生物的16SrDNA文库,初步分析了红树林土壤样本的细菌群落组成,发现许多菌群曾经被报道存在PKS基因簇,约占整个细菌群落的75%.利用相关菌群的PKS酮基合成酶结构域(Ketosynthase,KS)的保守区域序列信息设计简并引物,并构建了KS DNA序列文库.经测序获得131条新型KS序列,该结果表明红树林土壤微生物中蕴含了许多新型的聚酮类化合物合成酶.为了进一步获得聚酮合酶基因(簇),我们通过土壤微生物宏基因组Cosmid文库的构建与筛选,得到了13个属于trans-AT PKS,cis-AT PKS,NRPS/PKS Hybrid等类型的聚酮合酶的基因(簇),并通过构建KS序列的系统进化树分析了样本中聚酮合酶的多样性组成.     

荧光假单胞菌phlD基因的克隆、表达及功能

对荧光假单胞菌合成2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)操纵子的关键基因phlD进行了克隆,并采用E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)对phlD进行了诱导表达,其指导合成的PhlD蛋白融合表达后为42000Da.生物信息学方法分析PhlD具有PKSⅢ型聚酮合酶的结构及催化聚酮缩合、酰基转移反应的功能,并推测PhlD催化底物丙二酸单酰辅酶A经过聚酮缩合途径合成间苯三酚及其衍生物.对重组菌进行了摇瓶发酵并检测出发酵液中确有产物间苯三酚的合成.     

豌豆中GPAT基因编码cDNA的克隆及分析

参照国外报道的豌豆ＧＰＡＴ基因ｃＤＮＡ序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，通过ＲＴＰＣＲ技术，从云南地方栽种的豌豆品种中分离到了ＧＰＡＴ基因的编码ｃＤＮＡ片段，并将其纯化后直接克隆到ｐＧＥＭＴ载体系统中，经ＮｃｏⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切鉴定，所得的重组质粒中含有１３８０ｂｐ左右的片段．采用ＰｓｔⅠ，ＨｉｎｄⅢ两种限制性内切酶进行酶切，酶切图谱分析表明所克隆的豌豆ＧＰＡＴ基因编码ｃＤＮＡ的酶切图谱与国外所报道的该基因ｃＤＮＡ的酶切图谱一致，暗示了该基因在进行上具有一定的保守性．     

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

小拟南芥液泡膜H~+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。     

查尔酮合酶基因的克隆及双元载体的构建

以中国水仙为材料，利用RT-PCR方法克隆查尔酮合酶基因(CHS)的cDNA，核酸序列分析表明，该基因的编码区长1167bp，编码389个氨基酸，通过进一步的中间克隆，将CHS连上CaMV35s启动子和Tnos终止子。进一步将重组片段插入植物表达载体pCAMBIA1301,PCR及测序结果都证明植物双元表达载体p1301BΩＣ构建获得成功。为进一步在植物中表达CHS奠定了基础。     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

4种竹子木质素合成酶PAL的基因克隆和序列分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia—Lyase,PAL;EC4．3。1．5）是木质素生物合成过程的关键酶和限速酶。应用RACE（Rapid—Amplification of cDNA Ends）方法,获得了白哺鸡竹（Phyllostachys dulcis）、高节竹（Phyllostachys prominens）、龙鳞竹（Phyllostachys pubescens heterocycla）、丽水苦竹（Fveioblastus maculosoides Wen）等4种竹子PAL基因的全长序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,PAL基因的开放读码框长度为2136bp,共编码712个氨基酸,具有2个外显子和1个内含子。其中高节竹、龙鳞竹、丽水苦竹PAL基因内含子长度为121bp,白哺鸡竹朋L基因内含子长度为84bp。推测其氨基酸序列,并分析PAL蛋白单体的三维结构,结果显示PAL蛋白均含有大量的α螺旋和β折叠结构。基于邻接法的进化树对31个物种的PAL基因的氨基酸序列分析表明。竹类植物PAL基因的保守性较高,与禾本科植物玉米、甘蔗的亲缘关系较近,与双子叶植物辣椒等的亲缘关系较远。     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

漆酶的分子生物学研究及其应用

白腐菌所分泌的木质素降解酶主要有3种：木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶．漆酶是近年来研究较多的一种含铜的多酚氧化酶，在白腐菌中普遍存在，也存在于少数低等真菌和植物中．漆酶多为酸性蛋白，含4个铜离子，形成3个活性区域；表面一些氨基酸被不同程度地糖基化．漆酶可催化的底物迭250种，铜离子结合区域在其催化氧化过程中起决定性作用．运用PCR技术cDNA文库技术，越来越多的漆酶基因被克隆，目前已克隆到的漆酶基因有大约20个．许多来源地基因都是以家族地形式存在于染色体上的．已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子，这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性．一些特珠序列存在与否决定了该酶的表达形式-诱导型或组合型．目前已有部分漆酶基因的异源表达获得成功．本文还介绍了漆酶在环境保护、造纸工业、食品工业等方面的应用．对近年来漆酶的研究进展进行了综述．     

拟南芥Formin家族蛋白AFH14基因的克隆及功能结构域分析

应用RT-PCR的方法从拟南芥cDNA中克隆了AFH14的全序列,并对其功能结构域进行分析。发现所克隆的目的基因编码区全长3 102 bp,与基因组序列比对发现该基因包含18个内含子和18个外显子,编码1 033个氨基酸残基。通过与其它formin成员的序列比对分析,发现AFH14是一个典型的拟南芥II型formin,包括PTEN结构域。     

小麦果聚糖合成酶基因6-SFT克隆和功能验证

许多研究表明植物中果聚糖累积有助于提高植物耐逆境胁迫能力,但对小麦中果聚糖合成相关基因及其与抗逆性关系还缺乏研究。本研究拟从普通六倍体小麦中克隆出果聚糖合成酶基因6-SFT并进行生物学特性及功能研究,以期解析小麦通过累积果聚糖途径提高自身抗逆境胁迫能力的分子机理,为转6-SFT基因提高小麦抗逆境胁迫能力提供理论依据。利用touch-down PCR技术从小麦品种杨麦6（Triticum aestivum cv. Yangmai 6）基因组及cDNA中分离出编码6-SFT基因的全长序列,运用生物学信息技术对其编码蛋白的相关理化及生物学功能进行了预测,同时利用农杆菌介导法将所克隆的小麦6-SFT基因转入了烟草,对转基因烟草植株进行了抗旱、抗盐和抗低温鉴定。结果表明,小麦中6-SFT基因的gDNA和cDNA长度分别为3134bp和1851bp,序列结构分析表明该基因含有4个外显子、3个内含子,编码产物为约68kD的蛋白质,其等电点（pI）约为5.25,具有液泡定位信号;转小麦6-SFT基因烟草植株表现出较强的抗旱、抗盐和抗低温能力。本研究为利用基因工程技术改良小麦抗逆性提供重要理论依据。     

小立碗藓CAS基因的克隆及与拟南芥CAS基因的比较

钙信号在动植物的生长、发育过程中具有不可替代的作用.胞外钙受体(Extracellular Calcium-sensing receptor,CAS)是动植物质膜上一种跨膜离子通道蛋白,可以感受胞外Ca2 水平,充当第一信使将胞外的信号传递到细胞内.但迄今为止,仅2003年从植物拟南芥中克隆了胞外钙受体CAS基因,其起源进化我们知之甚少.本实验成功克隆了小立碗藓CAS基因,其cDNA全序列共1 574 bp,5′-非翻译区80个核苷酸,3′-非翻译区234个核苷酸,开放阅读框(ORF)1 257 bp,编码419个氨基酸,共有6个内含子.虽然藓类植物与被子植物进化距离较远,但小立碗藓CAS基因前五个内含子的插入位置以及相位与拟南芥完全相同,这说明植物中CAS基因在漫长的进化过程中非常保守,暗示被子植物胞外钙离子信号感受、传递机制起源于藓类植物.     

微泡菌ALW1几丁质酶Chi18A的克隆及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.)ALW1的基因组为模板,利用几丁质酶基因的特异性引物进行PCR扩增,然后将产物插入到pMD18-T载体后进行DNA序列测定,并对目的基因编码的蛋白质序列进行信息学分析。结果显示,克隆的目的基因大小为1644 bp,预测编码含有547个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的几丁质酶序列具有70%左右的相似性,表明预测目的基因编码几丁质酶。该蛋白质具有2个几丁质结合结构域和1个GH18家族酶的催化结构域,属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)家族18,命名为几丁质酶Chi18A。模拟的三维结构显示,Chi18A含有(βα)_8桶状结构。