井冈霉亚基胺A高产突变株的构建

通过接合转移将一个带有阿泊拉抗性基因和双交换臂的穿梭质粒pJTU609导入井冈霉素高产菌株吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinganggensis)DX546中,将负责井冈霉素A生物合成最后一步糖基转移中的糖基转移酶基因valG置换突变,多聚酶链式反应结果显示valG被阿泊拉霉素抗性基因成功置换,通过高压液相色谱检测证实突变株的发酵产物中井冈霉亚基胺A的产量得到大幅提高.     

对氨基苯甲酸生物合成基因pabAB的缺失对抗生素FR-008生物合成的影响

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素,它以对氨基苯甲酸(PABA)为起始单位,在I型聚酮合酶(PKS)的催化下合成聚酮内酯环.前期生物合成基因簇序列测定发现了可能的对氨基苯甲酸生物合成基因(pabAB),编码4-氨基-4-脱氧-分支酸(ADC)合成酶.通过同框缺失实验获得pabAB发生缺失的基因置换突变株BLQ-1并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增进行了验证.高效液相色谱(HPLC)分析和生物测定证实突变菌株BLQ-1丧失了合成抗生素FR-008的能力.这种产量的丧失可以通过回补克隆的pabAB基因或喂养外源PABA得到回复.实验证明,pabAB负责对氨基苯甲酸的合成,是抗生素FR-008生物合成的必需基因.     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

聚合酶链式反应递缩基因组文库以克隆抗生素生物合成基因簇

在克隆阿维菌素(avermectin)生物合成基因簇的过程中,探索出了一条运用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术对链霉菌基因组文库进行递缩法筛选、以克隆抗生素生物合成基因簇的新方法.依次以96孔培养板整板混合质粒、单排混合质粒和单个菌落为模板进行PCR扩增,以逐步递缩的方式定位包含目的基因的克隆.结果表明,与传统的菌落原位杂交方法相比,该方法具有简单、快捷、准确率高等优点.     

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.     

林可霉素转运蛋白基因lmrC的功能分析

为了研究腺苷三磷酸结合盒转运蛋白LmrC是否参与林可霉素的生物合成,通过同源重组在林可霉素高产菌株LC-G中构建了lmrC的缺失突变株XJJ7.高效液相色谱(HPLC)分析和抗性检测显示,相比出发菌株LC-G,XJJ7的林可霉素产量下降了55%,而且耐受林可霉素的最高质量浓度降低了50%.进一步实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析发现,突变株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA和lmbR的转录明显低于LC-G,但调控基因lmbU的转录不变.在LC-G中lmrC的过表达不能进一步提高产量,也不影响lmbA、lmbR和lmbU基因的转录,但过表达菌株对林可霉素的抗性显著增强.结果表明,lmrC可以通过影响生物合成基因的转录来调节林可霉素的产生,并赋予产生菌一定的抗性.