微杆菌Microbacterium sp.FY1538降解赤霉烯酮的活性研究

赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)主要是由镰刀菌属(Fusarium sp.)的某些种,如禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等通过聚酮类合成代谢途径生成并分泌的一种真菌毒素,具有类雌激素的性质.ZEN能引起家禽家畜和人的雌激素过多症,造成生殖紊乱、肝肾损伤,严重时可以致癌.本研究用环戊酮作为唯一碳源,从土壤中筛选获得一株可以有效降解ZEN的微杆菌(命名为Microbacterium sp.FY1538).该微杆菌在添加甲醇的LB培养基中发酵所得的上清液具有降解ZEN的活性.进一步的分析证明了FY1538培养液上清中含有能够降解ZEN的酶.经高效液相色谱分析,发现了ZEN生物降解的初步产物.     

产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究

普鲁兰降解酶(pullulan degrading enzymes)能够专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键以及特定位置的α-1,4-糖苷键,在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义.本研究采用唯一碳源法从稻田土样中培养筛选到21株产普鲁兰降解酶的菌株.对菌株A1的鉴定及其产生的普鲁兰降解酶的分析表明,该菌株为气单胞菌属,其产生的酶属于Ⅰ型普鲁兰酶(Type I pullulanase,EC 3.2.1.41),专一水解普鲁兰多糖α-1,6-糖苷键.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0,具有良好的温度稳定性和适应性;同时在pH为4.0时仍然保留50%的酶活.进一步对A1菌株产酶的发酵条件(pH、温度、时间)进行了优化,摇瓶中A1分泌表达Ⅰ型普鲁兰酶的水平达到21.2 U/mL.根据已报道的气单胞菌属普鲁兰酶基因的保守序列设计引物,克隆获得了4 053 bp的A1普鲁兰酶基因pluA1全长序列,编码1351个氨基酸.本研究结果为该酶的开发应用奠定了基础.     

信号肽对木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中分泌表达的影响

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种新型的非常规酵母,具有生长快、分泌能力强、安全性高等优势.在酵母表达系统中,分泌信号肽不仅介导了外源蛋白沿着正确途径分泌到胞外,也在蛋白质翻译后加工等方面发挥了重要作用.本文分别研究了酿酒酵母α-Factor信号肽和克鲁维酵母菊粉酶信号肽对耐热木聚糖酶在马克斯克鲁维酵母中的分泌表达影响.工程菌摇瓶发酵72h后,在含有菊粉酶信号肽和α-Factor信号肽的工程菌株的发酵上清中,木聚糖酶酶活分别为318.91U/mL和117.90U/mL,表明马克斯克鲁维酵母表达木聚糖酶时,菊粉酶信号肽介导的蛋白分泌表达效果优于α-Factor信号肽.重组表达木聚糖酶最适反应条件是pH5.5和65℃,在75℃处理1h后,该酶的剩余酶活保留73%以上.在5L发酵罐中,重组菌高密度发酵72h,木聚糖酶酶活高达157 757U/mL,结果表明,马克斯克鲁维酵母表达系统在工业酶领域中应用具有非常广阔的前景.     

马克斯克鲁维酵母FIM1基因组分析

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种富有潜力的新型细胞工厂宿主菌。K.marxianus FIM1(CGMCC No.10621)基因组组装与注释已于2019年完成并在NCBI上公布(GCA＿001854445.2),但在应用该基因组信息时发现其仍不完善。所以本研究使用重测序的DNA-seq数据校验了K.marxianus FIM1的基因组序列，随后补充了K.marxianus FIM1的注释，并使用比较基因组学的方法进一步完善了K.marxianus FIM1的基因组信息。根据重测序比对结果，删除了测序数据无法覆盖的位点61处，共4 910 bp。K.marxianus FIM1新序列总长为10 909 543 bp,可覆盖酵母目保守基因库中99.5%的基因。同时对K.marxianus FIM1的非编码RNA、次级代谢产物基因簇的也进行了补充注释。进一步，我们使用基因组共线性分析的方法分析了K.marxianus FIM1在物种分化过程中基因排列顺序保守的区域，并将K.marxianus FIM1与NCBI公布的11株K.marxianus进行了...     

一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的无痕基因组改造方法

马克斯克鲁维酵母位于酵母科克鲁维属,具有高分泌能力、高生长速率、多底物利用以及耐高温等特点,具有工业应用前景.因此,建立马克斯克鲁维酵母的基因工程改造技术十分重要.本文以马克斯克鲁维酵母URA3基因缺陷菌株为出发菌株,依据同源重组原理,选用KmURA3作为可循环使用的筛选标签基因,建立了一种针对马克斯克鲁维酵母的无残留多基因敲除技术,以满足其遗传工程改造的需求.本研究利用这种技术成功构建了Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株营养缺陷型菌株,为马克斯克鲁维酵母的分子遗传学研究以及工业应用研究提供了遗传材料.     

人超氧化物歧化酶-胸腺素α1融合蛋白在毕赤酵母中的表达与活性检测

为了增强胸腺素α1(Thyα1)的稳定性和免疫功能,采用胸腺素α1与人超氧化物歧化酶(hSOD)融合的策略,构建了6HishSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1 2个融合基因,并分别在毕赤酵母中实现了高水平表达.重组表达的融合蛋白经过Ni-NTA亲和层析纯化后,纯度达到80%以...     

CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫

猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已经逐渐成为我国的主要流行毒株.本研究利用马克斯克鲁维酵母研究了2.1b型CSFV E2蛋白及其截短体mE2(690-916aa)在马克斯克鲁维酵母中的重组表达,发现去除E2蛋白跨膜区域可以显著提高E2蛋白表达水平,mE2的表达量在5L发酵罐中达1.25～2.5g/L.经分子筛纯化,mE2蛋白纯度达90%.纯化的mE2作为抗原蛋白,注射免疫小鼠28d后,可诱导小鼠产生抗CSFV的IgG特异性抗体,表明马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2蛋白具有较好的免疫原性.     

玉米赤霉烯酮降解酶在马克斯克鲁维酵母中的表达及高产菌株的诱变筛选

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌属霉菌产生的一种霉菌毒素,常见于霉变的玉米、小麦等谷物中.研究发现,来源于粉红黏帚霉(Gliocladium roseum)的α/β水解酶ZHD101能够断裂ZEN的内酯键,破坏ZEN的毒性.本文利用食品安全级的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)重组分泌表达了ZHD101,发酵液上清中的表达产物具有水解ZEN的活性.利用UV和~(60)Co-γ联合诱变方法,提高了ZHD101在马克斯克鲁维酵母中的表达水平.高效液相色谱(HPLC)分析表明,重组菌株分泌表达的ZHD101酶蛋白既能水解标准品ZEN,又能在较温和的条件下水解发霉玉米样本中的ZEN,结果表明该重组菌株表达的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101,可应用于发霉玉米的脱毒处理.     

新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶RuAra1的表达与鉴定

随着能源问题的日益突出,半纤维素资源的利用逐渐受到人们的重视.α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Larabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)属于半纤维素酶系,能水解以α-1,3、α-1,2或α-1,5键连在木聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支.本实验室将克隆得到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因RuAral在大肠杆菌中重组表达,得到的重组阿拉伯呋喃糖苷酶RuAral能够水解4-硝基酚-α-L-阿拉伯糖苷(4-Nitrophenyl-α-Larabinofuranoside,pNPA)、4-硝基酚-β-D-吡喃木糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,pNPX)以及从小麦阿拉伯木聚糖中水解释放阿拉伯单糖.以pNPX为底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.RuAral与瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)内切木聚糖酶XynCIDBFV、瘤胃细菌木糖苷酶RuXynl的组合使用可以实现对小麦阿拉伯木聚糖的协同降解,且降解效率优于德国AB酶制剂公司的商品酶ROHALASE WP.