L-苏氨酸镁对多巴胺神经元的保护作用及其机制

为观察L-苏氨酸镁(MgT)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型的神经保护作用,探讨其可能的机制,本文建立PD小鼠模型,将小鼠随机分为对照组、MPTP组、MPTP+MgT组,采用旋转棒法观察小鼠行为变化,TH染色法观察黑质多巴胺神经元数目变化,蛋白质免疫印迹法检测黑质和纹状体胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果表明:MPTP+MgT组在旋转轴上停留的时间比MPTP组延长68.07%;MPTP+MgT组黑质多巴胺神经元数目比MPTP组增加46.15%;MPTP+MgT组黑质和纹状体GFAP、iNOS、TH的表达量与MPTP组比较,差异有统计学意义(P0.05)。可见MgT神经保护作用的机制可能与下调GFAP、iNOS表达,以及抑制炎症、氧化应激有关。     

6-羟基多巴胺所致急性帕金森病大鼠模型的复制

采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)纹状体内注射法制作急性帕金森病大鼠模型,为抗帕金森病药物的快速药效学研究提供新的方法.方法10只大鼠随机分为对照组和模型组.给对照组大鼠脑纹状体内注射等量生理盐水、模型组同一部位注射6-OHDA 4μL(12μg/4μL)制作大鼠多巴胺(DA)能神经元损伤的急性模型,术后第7d进行微透析试验,将透析液注入高效液相一电化学检测器(HPLC-ECD)测定各组纹状体细胞外液中DA、3,4-二羟基苯乙酸(DOPA C)和高香草酸(HVA)的含量.结果与对照组相比,模型组动物纹状体细胞外液中DA、DOPAC和 HVA含量均显著性降低,具有统计学差异(P<0.05,P<0.01或P<0.001).采用6-OHDA纹状体内注射法可以复制急性帕金森病大鼠模型.     

NGF诱导PC12细胞转化为神经样细胞微管相关蛋白2(MAP2)的表达

目的探讨神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化为神经元样细胞时MAP2的表达变化情况.方法细胞培养6 d后应用共聚焦显微镜观察MAP2表达情况;Western Blot法检测诱导不同时间点MAP2的表达情况.结果免疫组化结果显示:MAP2表达呈阳性;免疫印迹结果显示:MAP2蛋白表达在不同时间点呈动态变化,即随诱导时间延长呈递增趋势.结论 NGF成功诱导PC12细胞分化为神经样细胞,为缺血性脑卒中的体外细胞研究提供细胞参考.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.     

运动干预对帕金森病大鼠黑质DJ-1的表达和抗氧化物酶的影响

探讨早期运动干预对帕金森病(PD)模型大鼠黑质多巴胺(DA)能神经元的抗氧化保护机制.选清洁级SD大鼠64只分为4组:假手术组(Control,12只)、假手术运动组(Control+Ex,12只)、PD组(PD,20只)和PD运动组(PD+Ex,20只).单侧前脑内侧束(MFB)注射6-OHDA建立PD模型大鼠,运动组术后24h开始进行持续4周跑台训练,11m·min~(-1) ,30min·d~(-1) ,5d·(7d)~(-1) .采用阿扑吗啡(APO)诱导旋转检测行为变化,应用PCR和Western blotting检测黑质DJ-1变化,比色法检测黑质超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)指标.黑质DJ-1基因表达显示,PD+Ex组比PD组分别明显增加(P0.05);黑质DJ-1蛋白表达显示,PD+Ex组较PD组有明显提升(P0.05);PD组大鼠SOD、GSH-Px活力明显低于Control组(P0.01),MDA含量显著高于Control组(P0.01);PD+Ex组大鼠SOD、GSH-Px活力和MDA含量与Control组和PD组均有显著性差异(P0.05).表明早期运动干预能提高黑质DA能神经元DJ-1并增强抗氧化应激能力.     

抗坏血酸定向诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经细胞及其机理研究

神经干细胞(NSCs)是神经系统发生的始祖细胞,具有自我更新和多向分化潜能.NSCs的研究不仅对阐明神经系统发育有重要意义,对神经系统疾病的治疗也提出了新的思路.研究NSCs定向分化的诱导因素和机制对NSCs的应用具有重要意义.本实验在体外神经干细胞培养鉴定和扩增的基础上,观察了抗坏血酸(AA)对NSCs定向诱导分化作用,并探讨了分化过程中相关基因表达的变化和可能的信号传递途径.结果表明AA诱导能明显促进多巴胺能神经细胞特异性酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运子(DAT)mRNA和蛋白表达;NSCs表达Ptx3和较弱的Nurr1,不表达TH,DAT和Shh;诱导后Ptx3表达无变化,Nurr1,Shh,TH和DAT表达增强.Erk阻断剂PD98059能阻断AA对Nurr1,TH,DAT mRNA的作用.提示Nurr1参与AA定向诱导,AA可能通过Erk1/2信号转导途径起作用.研究为获得足够的治疗帕金森氏病的多巴胺能神经元提供了新的思路,并对AA定向诱导的机制进行了初步研究,对更好地发挥NSCs移植治疗帕金森氏病具有重要意义.     

注射用罗替戈汀微球延缓MPTP致神经元损伤作用探讨

本研究旨在通过模拟持续多巴胺能刺激(CDS)给药方式,评价注射用罗替戈汀缓释微球(Rotigotine Extended-release Microspheres for Injection,RoMS)对帕金森病(PD)小鼠神经元损伤的延缓作用.采用MPTP小鼠PD模型,并随机分为正常组、模型组、左旋多巴组、RoMS组、左旋多巴与RoMS联合给药组,在给药期间进行行为学检测,给药结束后,分析各给药组对氧化应激相关蛋白n NOS、Cyt-C及黑质酪氨酸羟化酶(TH)表达水平的影响.结果表明,RoMS和联合用药组可明显延长小鼠转棒、悬尾、强迫游泳时间,下调黑质中n NOS、Cyt-C的含量,增加TH神经元的表达.本研究说明,RoMS具有抗氧化应激,减轻多巴胺神经元损伤,改善运动障碍的作用,并且在联用低剂量L-DOPA时,可同时发挥协同增效和神经保护作用.     

NGF诱导PC12细胞神经元样细胞分化

目的:建立PC12细胞的神经元样细胞分化模型,并探讨ERK蛋白在PC12细胞神经元样细胞分化中的可能机制.方法:以10、20、50 g/L的NGF(NGF溶于PBS,培养基中PBS的终浓度不超过2%)培养PC12细胞,应用倒置相差显微镜、显微镜测微尺及流式细胞仪鉴定PC12细胞的分化,以确定NGF使用剂量.运用免疫印迹检测不同浓度、不同作用时间时ERK蛋白在PC12细胞中的表达,并进行统计学分析.结果:随NGF剂量的升高,PC12细胞的体积、最长突起长度和突起数目均会增大或增多。统计学分析证明50 g/L的NFG作用48 h足以诱导PC12细胞的交感神经样改变。尽管ERK总蛋白水平在NFG作用前后无明显改变,但在NFG作用5 min后磷酸化的ERK蛋白水平即显著升高,达到峰值,并持续约1 h.50 g/L的NFG作用于PC12细胞48 h可使细胞发生明显的G1期阻滞.结论:PC12细胞可在NGF作用下出现交感神经样改变,并且细胞的分化程度依赖于NGF的使用剂量和作用时间.在NGF诱导的PC12细胞神经元样分化中ERK蛋白的磷酸化对NGF呈现剂量和时间依赖性,提示ERK蛋白在分化的早期发挥重要作用.     

高糖诱导ADTIQ的生成和多巴胺的代谢失衡

 2 型糖尿病患者比正常人更容易患帕金森病(PD),而新内源性神经毒素1-乙酰基-6, 7-二羟基-1, 2, 3,4-四氢异喹啉(ADTIQ)可能成为2 型糖尿病并发PD 的一个关键因素,ADTIQ 是由丙酮醛与多巴胺反应合成,但是其在多巴胺能神经元中的生成条件,以及在糖尿病情况下ADTIQ 的生成是否影响多巴胺代谢尚不清楚。本研究以SH-SY5Y 细胞为模型,研究ADTIQ 在细胞模型中的生成条件,发现ADTIQ 是在葡萄糖代谢旺盛的条件下,丙酮醛内源性产生与神经元内的多巴胺反应生成。研究揭示,高糖条件下,SH-SY5Y 细胞和2 型糖尿病的大鼠模型中外周多巴胺的质量浓度减少,而与多巴胺合成和转运相关的酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体合成增加。可见,高糖能诱导SH-SY5Y 细胞内ADTIQ 的生成和多巴胺代谢的失衡,ADTIQ 的生成可能成为糖尿病并发PD 的关键因素。     

Cdk5及p35在NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨Cdk5及p35在神经生长因子(NGF)撤退诱导的PC12细胞凋亡中的作用机制.方法:建立NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡模型,Western blotting检测Cdk5及p35在凋亡过程中表达变化情况,利用Cdk5特异性抑制剂Roscovitine预处理已分化PC12细胞,检测其对NGF撤退诱导的凋亡作用影响,向已分化PC12细胞转染真核表达质粒pCMV-p35-IRES-Cdk5,检测过表达CdkS/p35对PC12细胞凋亡的影响.结果:NGF撤退36h会引起已分化PC12细胞出现典型的DNA Ladder凋亡特征,MTT检测结果也显示,NGF撤退对PC12细胞的损伤呈时间依赖性;Roscovitine预处理已分化PC12细胞可以抑制NGF撤退诱导的细胞凋亡率,但不影响Cdk5/p35蛋白表达水平;向已分化PC12细胞中转染真核表达质粒后,能检测到Cdk5/p35蛋白的过表达,并引起PC12细胞出现凋亡样改变.结论:Cdk5及p35的活化与NGF撤退诱导的已分化PC12细胞凋亡过程密切相关,抑制Cdk5的活化有抑制细胞凋亡保护神经元的作用.     

多壁碳纳米管-神经生长因子复合物的制备及生物活性测定

为探讨采用羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs—COOH）非共价接枝神经生长因子（NGF）制备碳纳米管神经生长因子（MWCNTsNGF）复合物,考察复合物的生物活性。采用透射电子显微镜（TEM）表征MWCNTs—NGF复合物的微观形貌,酶联免疫吸附法（ELISA法）测定MWCNTs—NGF复合物载带NGF的量,MTT法测定了MWCNTs—NGF复合物的对嗜铬细胞瘤细胞（PCI2细胞）的毒性,PCI2细胞培养法评价复合物的生物活性,TEM表征复合物与细胞的分布情况。结果：TEM图像表明NGF连接到了MWCNT上,EI．ISA法测得MWCNTsNGF复合物载带NGF的量为797．63pg／mg,MWCNTs—NGF复合物对PCI2细胞有一定的毒性,生物活性试验表明NGF浓度相同的情况下,MwCNTs—NGF复合物组PCI2细胞的分化率明显高于NGF组。TEM图像表明碳纳米管能进入细胞。结论：碳纳米管能载带NGF进入细胞,使NGF能更好的表达生物活性。     

红藻氨酸致癫痫大鼠不同时点神经生长因子变化研究

摘要: 目的 探讨红藻氨酸( Kainic Acid,KA) 致癫痫大鼠癫痫发作过程中海马组织神经生长因子( nerve growth factor,NGF) 不同时间点表达量的变化。方法 腹腔注射 KA 建立大鼠癫痫模型。采用 TaqMan 探针实时定量 PCＲ ( Ｒeal-time quantitative PCＲ) 技术,检测注射 KA 后不同时点大鼠海马组织中 NGF 表达量的变化。结果 与 NGF 表达量与生理盐水对照组( NS) 相比,6 ～ 12 h NGF 表达量明显低于 NS 组( P ＜ 0. 05) 、48 ～ 72 h NGF 表达量开始升高并高于 NS 组,在 24、72 h 时其表达量显著高于 NS 组( P ＜ 0. 05) 。结论 NGF 对致癫大鼠的海马具有修复与保护作用。     

Antagonistic effect of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) on generation of immunosuppressive protein of stress in the rat

Neonatal rats were injected with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) for chemical sympathectomy. The rats were treated with restraint stress when they grew up to 56 d. It has-been found that the generation of immunosuppressive protein of stress (ISPS) is significantly reduced, suggesting that peripheral sympathetic nerve plays an important role in mediating the generation of ISPS.     

虫草素对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的应用Aβ25-35孵育PC12细胞制作细胞损伤模型,探讨虫草素对PC12细胞损伤的保护作用.方法将不同组别PC12细胞用Aβ25-35诱导48 h后,采用MTT法测定细胞活力,LDH法测定细胞膜通透性,化学比色法测定细胞中SOD活性和MDA含量,Western blot法检测PC12细胞中Caspase-3的表达.结果与模型组相比,两种剂量的虫草素均使细胞存活率显著增加,细胞培养上清中LDH含量显著减少,细胞中SOD活性显著升高,MDA含量显著下降,并明显降低PC12细胞Caspase-3的表达.结论虫草素对Aβ25-35诱导的PC12细胞死亡、氧化损伤和细胞凋亡有明显保护作用.     

对大鼠PC12细胞用于定量测定神经生长因子活性两种方案的评价

建株的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤ＰＣ１２细胞，在神经生长因子ＮＧＦ的作用下，会长出神经突起。这一现象被用于神经生长因子的活性测定。但就定量测定而言、目前已 方法，方案，包括判定阳性细胞的标准，均有一定差异，而我国也尚未建立起对这一重要的 活性的标准测定法。     

跑台运动通过增强星形胶质细胞Glu的摄取转运功能改善PD模型大鼠运动功能

本文选取雄性SD大鼠,随机分为4组:假手术组(Control)、假手术运动组(Control+Ex)、PD组(PD)和PD运动组(PD+Ex).于大鼠内侧前脑束注射6-羟基多巴(6-OHDA)建立单侧损伤PD模型,术后24h实施运动干预.在手术后第1周、第2周和第4周皮下注射阿朴吗啡(APO)评价PD模型可靠性.4周训练结束后进行圆筒与网格行为学测试,并利用高效液相色谱技术(HPLC)检测纹状体Glu浓度;采用免疫组织化学技术观察纹状体GFAP和GLT-1的表达水平.APO旋转行为测试和圆筒及网格行为测试结果显示,PD+Ex组大鼠行为功能较PD组显著改善(P0.05).PD+Ex组大鼠较PD组纹状体Glu浓度下降(P0.01),GLT-1表达显著上调,而GFAP的表达显著下调(P0.05).4周跑台运动干预可加速星形胶质细胞对Glu的摄取转运能力,降低纹状体Glu浓度,改善PD模型大鼠行为功能障碍.推测运动促进PD模型大鼠皮层-纹状体Glu能通路的突触可塑性可能也与星形胶质细胞对Glu的摄取转运功能有关.     

Novel neurotrophic factor CDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo

In Parkinson's disease, brain dopamine neurons degenerate most prominently in the substantia nigra. Neurotrophic factors promote survival, differentiation and maintenance of neurons in developing and adult vertebrate nervous system. The most potent neurotrophic factor for dopamine neurons described so far is the glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF). Here we have identified a conserved dopamine neurotrophic factor (CDNF) as a trophic factor for dopamine neurons. CDNF, together with its previously described vertebrate and invertebrate homologue the mesencephalic-astrocyte-derived neurotrophic factor, is a secreted protein with eight conserved cysteine residues, predicting a unique protein fold and defining a new, evolutionarily conserved protein family. CDNF (Armetl1) is expressed in several tissues of mouse and human, including the mouse embryonic and postnatal brain. In vivo, CDNF prevented the 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced degeneration of dopaminergic neurons in a rat experimental model of Parkinson's disease. A single injection of CDNF before 6-OHDA delivery into the striatum significantly reduced amphetamine-induced ipsilateral turning behaviour and almost completely rescued dopaminergic tyrosine-hydroxylase-positive cells in the substantia nigra. When administered four weeks after 6-OHDA, intrastriatal injection of CDNF was able to restore the dopaminergic function and prevent the degeneration of dopaminergic neurons in substantia nigra. Thus, CDNF was at least as efficient as GDNF in both experimental settings. Our results suggest that CDNF might be beneficial for the treatment of Parkinson's disease.     

Dopaminergic D-3 binding sites are not presynaptic autoreceptors

Postsynaptic dopamine (DA) receptors have been classified biochemically and pharmacologically into two types: D-1 receptors mediate adenylate cyclase stimulation, demonstrating micromolar affinity for DA and butyrophenone antagonists; D-2 receptors mediate adenylate cyclase inhibition, demonstrating nanomolar affinity for DA and butyrophenone antagonists. D-1 receptors are labelled by 3H-thioxanthene antagonists, while D-2 receptors are labelled by both 3H-agonists and all 3H-antagonists. A third class of dopaminergic binding site, termed D-3, represents high-affinity 3H-agonist binding sites demonstrating low, micromolar, affinity for butyrophenones. In the rat striatum, D-3 sites were decreased 50% by 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lesions of the nigrostriatal DA pathway, suggesting that such D-3 binding labels presynaptic DA autoreceptors on nigrostriatal terminals. However, nigrostriatal denervation produces a concomitant depletion of striatal DA. Here we demonstrate that a reserpine-induced depletion of DA produces a decrease in D-3 binding comparable to that seen with nigrostriatal denervation, independent of presynaptic terminal degeneration. This loss in binding, or that caused by 6-OHDA lesions, is recovered by preincubating the striatal membranes with DA or with the supernatant from control striatal membrane preparations. We therefore suggest that the loss of D-3 binding following 6-OHDA lesions results from the depletion of endogenous DA rather than the degeneration of terminals and their putatively associated autoreceptors.