极小种群喙核桃ISSR-PCR反应条件的建立与优化

本文采用正交和单因素相结合的方法研究dNTPs、Mg²⁺、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、循环次数及退火温度对喙核桃ISSR-PCR扩增效果的影响,以期为喙核桃遗传多样性评价、亲缘关系分析等研究奠定基础。结果表明：喙核桃最佳ISSR-PCR扩增体系及程序为20 μL的反应体系含dNTPs 0.5 mmol/L、Mg²⁺ 3.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 45 ng、10×PCR Buffer 2.0 μL。退火温度为54.4℃,循环次数为40。本研究建立的喙核桃ISSR-PCR反应体系稳定、可靠,可用于该物种遗传多样性分析。     

梨ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

以‘饼子梨’为试材,利用正交设计L16(45)研究了反应体系中引物、模板DNA浓度等5个因素4个水平对梨反应体系的影响,PCR结果应用极差分析和MINITAB软件对扩增结果进行方差分析.梨最佳ISSR-PCR反应体系:25μL反应体系中含2.5μL 10×Buffer,2.0mmol/L Mg2+,0.25mmol/L dNTPs,0.25μmol/L引物,60ng模板DNA,0.75UTaq DNA聚合酶.优化的ISSR-PCR反应体系稳定性高和重复性较好,为梨品种指纹图谱构建和遗传多样性分析奠定基础.     

黑老虎ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立和优化特色药食两用植物黑老虎（Kadsura coccinea）的ISSR-PCR反应体系和扩增程序,通过正交和单因素试验研究Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数等因素对黑老虎ISSR-PCR反应体系扩增效果的影响。结果表明,在20 μL的反应体系中,最佳扩增条件为Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.1 mmol/L、引物浓度0.6 μmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.50 U、模板DNA用量45 ng,退火温度50.4℃,循环40次。这一优化体系的建立可为深入开展黑老虎种质资源遗传多样性研究奠定基础。     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

地石榴ISSR扩增体系优化及应用

以地石榴为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子,如引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA浓度、退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合地石榴的IS-SR-PCR反应体系:20μL体系中,10×buffer 2.0μL,引物0.50μmol.L-1,dNTPs 0.15 mmol.L-1,Mg2+1.2mmol.L-1,Taq DNA酶1.25 U,模板DNA 25 ng.确定了适宜的退火温度为52℃.利用该优化后的体系从60条ISSR引物中筛选出了12条,随机选取2条对10份分布于不同地区的地石榴标本基因组DNA进行扩增,证实了该体系稳定可靠,可用于进一步分析地石榴居群遗传多样性.     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

五条蚋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过正交试验及单因素试验对五条蝻S.quinquestriatum ISSR-PCR反应体系中的引物、DNA模板、dNTP、Mg2+、BSA、Taq DNA聚合酶浓度6个关键因素进行优化,建立五条蚋ISSR最适反应体系:20μl反应体系中引物1.0 μmol/L、DNA模板50.0 ng/μl、dNTP 0.15 mmol/L、Mg2+ 1.50 mmol/L、BSA 2.00 mg/ml、Taq DNA聚合酶0.155U/μl.通过对24条备选引物进行温度梯度筛选,获得8条能够稳定扩增且多态性较好的引物.为今后利用ISSR技术进行五条蚋种群遗传多样性研究奠定了良好的技术基础.     

正交设计优化太子参ISSR-PCR反应体系

利用正交设计实验对影响太子参ISSR-PCR扩增的重要因素(d NTPs、引物、Taq酶、模板DNA浓度)进行优化,以建立太子参ISSR-PCR的优化反应的最佳体系,25μL反应体系中包含d NTPs300μmol/L,引物500nmol/L,Taq酶1U及模板DNA 50ng.适宜的扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性40s,46℃退火45s,72℃延伸2min,41次循环;最后于72℃延伸7min,4℃进行保存.该正交体系的建立,将为太子参种质资源鉴定及遗传多样性的研究提供技术支持.     

东方百合ISSR-PCR反应体系的正交优化

以东方百合‘Constanta’和‘Sorbonne’以及9份‘Constanta’בSorbonne’的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取百合嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)对东方百合ISSR-PCR反应体系的Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物5种因素在4个水平上进行优化试验,采用直观分析结合方差分析评价扩增结果。最终获得的最佳反应体系为:在20μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶0.5μmol/min、Mg2+1.75 mmol/mL、模板DNA 40～100 ng、dNTPs 0.15 mmol/mL、引物0.6μmol/L、10×PCR Buffer 2μL,不足部分以ddH2O补足。在获得最佳反应体系的基础上采用单因素实验确定了引物最佳退火温度范围为55～45℃,最佳循环次数为30次以及延伸时间为1.5 min。应用该优化的反应体系,对‘Constanta’和‘Sorbonne’以及9份‘Constanta’בSor-bonne’的F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的扩增稳定性。     

濒危植物长叶红砂ISSR扩增条件的优化与引物筛选

对濒危植物长叶红砂(Reaumuria trigyna Maxim)的核基因组DNA进行ISSR扩增条件的优化与引物筛选.利用单因素实验,测试了ISSR-PCR反应体系中模板DNA的含量、引物浓度、Master Mix等因素对反应结果的影响,经过优化实验,建立了长叶红砂ISSR-PCR的最佳反应体系,15μL PCR反应体积包括Mix 4.5μL,模板DNA 20ng,引物0.6μmol/L.利用优化反应体系,从60个ISSR引物中筛选出稳定性好、重复性高的14个引物.对长叶红砂5个种群的85个个体进行扩增,共扩增出110个位点,其中多态位点102个,多态位点百分率为92.73%.长叶红砂ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术进一步研究长叶红砂的遗传多样性奠定了良好的基础.     

海南普通野生稻ISSR-PCR反应体系的优化

通过不同浓度的Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度和循环次数的单因素试验,筛选海南普通野生稻最佳ISSR-PCR反应体系为:15μl反应体系中含2.0 mmol/L MgCl2,50 ng模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.20 U Taq酶,1.5μmol/L ISSR引物,50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3).反应程序:94℃预变性5 min;94℃,1 min,52℃,1 min,72℃,2 min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.     

爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

太行菊SRAP-PCR反应体系的建立与优化

相关序列扩增多态性（SRAP）是一种新发展起来的分子标记技术,在太行菊中还未见相关的报道。为建立优化适合太行菊SRAP分析的扩增体系,以太行菊DNA为模板,对影响SRAP-PCR反应体系的5个重要参数设置梯度进行单因素实验分析,以确定最佳的反应条件。经过大量的重复性实验确定了适合太行菊SRPA-PCR反应体系：20μL的反应体系中,模板DNA量50ng,1.25mmol/L的Mg2＋浓度,0.5μmol/L的上下游引物,0.2mmol/L的dNTPs以及Taq酶1U。该体系在太行菊个体中均能扩增出清晰稳定的条带,为后续的太行菊遗传多样性分析奠定了基础。     

干用辣椒RAPD—PCR反应体系正交优化的研究

以干用辣椒幼苗为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的Taq酶、Mg^2＋,dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度等影响因素,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有解体Taq酶1．5U、Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0．6mmol／L、引物0．8μmol／L、模板DNA60ng．扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性1min,37℃退火1min,72％延伸1．5min,40个循环;最后72℃副延伸5min．     

仁用杏SRAP-PCR体系的正交设计优化

改良CTAB法提取仁用杏基因组DNA,用于建立SRAP-PCR体系。采用L16（44）正交设计试验,对影响仁用杏SRAP-PCR反应体系的4因素（dNTPs浓度、Mg^2＋浓度、引物浓度、Taq聚合酶量）4水平进行筛选,PCR结果经统计软件SPSS V13.0分析,并对退火温度进行了摸索,确立了仁用杏SRAP-PCR的优化体系：总体积为20 L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg^2＋浓度为2.5mmol/L,引物浓度为0.9μmol/L,Taq聚合酶量为1.5 U,退火温度为52℃。本优化体系为仁用杏资源遗传分析奠定了技术基础。     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系(引物为中国鲎微卫星引物).并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系:总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件:模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立

以油茶品种大别山2号和赣兴46为试验材料,利用Me5Em8正反向引物组合进行了SRAP-PCR反应体系的L9(34)正交试验,采用正交设计直观分析及方差分析对影响SRAP反应的Taq聚合酶、Mg2+、dNTP和引物浓度进行分析,并对模板DNA浓度进行了单因素试验分析。结果表明,油茶SRAP-PCR 20 μL反应体系的最佳组合为: Taq聚合酶1.20 μmol/min、Mg2+浓度125 mmol/L、dNTP浓度0.15 mmol/L、Primer浓度0.60 μmol/L、模板DNA含量60 ng,并含有2 μL 10×buffer(Mg2+ free)。各因素对油茶SRAP-PCR反应的影响大小依次为:dNTP、 Mg2+ 、Taq聚合酶、Primer。     

杉木SRAP-PCR体系优化

为建立杉木SRAP-PCR反应体系,利用L₁₆(4⁵)正交设计对影响杉木SRAP-PCR反应体系的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5种因素的4个水平进行优化实验,结合正交直观分析和方差分析,对影响反应较大的Mg²⁺、dNTPs和引物浓度进行单因素实验,最终确定杉木SRAP-PCR最佳的反应体系为:在20 μL的PCR反应体系中,Mg²⁺浓度为2.25 mmol/L、dNTPs为0.15 mmol/L、引物浓度为0.4 μmol/L、Taq酶为1.5 μmol/min、模板DNA为60 ng,10×PCR Buffer 2 μL,不足部分用双蒸水补充至20 μL。PCR反应程序的两步最适退火温度第1步为35 ℃,第2步为53 ℃。利用上述反应体系进行杉木PCR扩增,能得到清晰、稳定的条带。     

贵州山核桃ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立贵州山核桃ISSR-PCR最佳反应体系,采用单因素试验的方法,对影响ISSR-PCR反应体系的模板DNA浓度、MgCl2浓度、d NTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等各因素进行了研究,确立了贵州山核桃ISSR-PCR的最佳反应体系。结果显示:最优反应体系的模板DNA浓度为40ng/u L、引物浓度为0.3umol/L、Mg2+的浓度2.9mmol/L、酶浓度0.3U、d NTPs浓度0.2mmol/L,退火温度为54℃。建立该反应体系可为贵州山核桃ISSR标记开发、物种分类鉴定、遗传图谱构建等后续分析奠定基础。