真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

藜ISSR-PCR反应体系的优化

采用TaKaRa的PCR反应系统,以从藜(Chenopodium album L)幼叶中提取纯化后的总DNA为模板,进行UBC 859号引物的ISSR-PCR扩增实验,分别测试了镁离子、模板DNA和Taq DNA聚合酶含量对反应结果的影响,通过各因子的浓度梯度组合实验,确定了在25 mL体积的PCR反应中:酶配套缓冲液2.5μL,dNTPs0.2μmmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,模板含量为40 ng,Taq DNA聚合酶为1.5 U是藜最佳的ISSR-PCR反应体系。     

均匀设计优化甘薯ISSR-PCR反应体系

为探索适宜甘薯的ISSR-PCR反应体系,采用两轮均匀设计试验,对ISSR-PCR反应体系中模板DNA、引物和2×Taq Master Mix的用量进行优化.结果表明:在10μL ISSR-PCR反应体系中,含模板DNA 1.4μL,引物0.9μL,2×Taq Master Mix 5.1μL.在此最佳条件下,利用UBC808引物对22个甘薯品种扩增的条带清晰、多态性好,表明此反应条件适合于甘薯的ISSR-PCR反应体系.     

五条蚋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过正交试验及单因素试验对五条蝻S.quinquestriatum ISSR-PCR反应体系中的引物、DNA模板、dNTP、Mg2+、BSA、Taq DNA聚合酶浓度6个关键因素进行优化,建立五条蚋ISSR最适反应体系:20μl反应体系中引物1.0 μmol/L、DNA模板50.0 ng/μl、dNTP 0.15 mmol/L、Mg2+ 1.50 mmol/L、BSA 2.00 mg/ml、Taq DNA聚合酶0.155U/μl.通过对24条备选引物进行温度梯度筛选,获得8条能够稳定扩增且多态性较好的引物.为今后利用ISSR技术进行五条蚋种群遗传多样性研究奠定了良好的技术基础.     

入侵植物春飞蓬DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的建立

以菊科入侵植物的春飞蓬为研究材料,采用CTAB法提取植物总基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度法检测提取的总DNA质量良好,蛋白质、RNA等杂质去除彻底,适合进行ISSR分析;将提取的DNA进行ISSR-PCR扩增,筛选出特异性高的引物,利用单因素和正交试验,建立并优化了入侵植物春飞蓬ISSR-PCR反应体系,20μL优化体系中DNA模板为20 ng、引物为0.2μmol/L、Mg2+为2.5 mmol/L、d NTP为0.2 mmol/L.     

阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因子试验和正交设计方法,对影响阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系的引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA及退火温度5个因素进行优化,为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性奠定基础.结果表明:阔叶十大功劳ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20μL反应体系中,0.5μmol/L引物、0.5UTaq酶、150μmol/L dNTPs和20ng模板DNA.在最佳反应条件下,从80条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并经过9份阔叶十大功劳种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点.综上所述,本文所建立的ISSR-PCR反应体系可用于阔叶十大功劳的种质鉴定及遗传多样性分析.     

流苏石斛ISSR-PCR反应体系的优化

以流苏石斛为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合流苏石斛ISSR-PCR分析的最佳反应体系.在20μL反应体系中含1×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,1.0 mmol/L dNTP s,1.0μmol/L引物,0.5 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35个循环;最后72℃延伸7 min.     

海南普通野生稻ISSR-PCR反应体系的优化

通过不同浓度的Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度和循环次数的单因素试验,筛选海南普通野生稻最佳ISSR-PCR反应体系为:15μl反应体系中含2.0 mmol/L MgCl2,50 ng模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.20 U Taq酶,1.5μmol/L ISSR引物,50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3).反应程序:94℃预变性5 min;94℃,1 min,52℃,1 min,72℃,2 min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存.     

三角梅SRAP-PCR反应体系的建立及引物筛选

利用L9(34)正交试验设计,对影响PCR反应的TaqDNA聚合酶量、dNTP浓度、Mg2+浓度和引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行了三角梅SRAP-PCR扩增反应条件优化研究,并对引物进行了全面筛选.三角梅SRAP-PCR优化反应体系结果为:2.5μL 10×PCR buffer、60ng模板DNA、TaqDNA聚合酶1.0U、dNTP 0.25mmol/L、Mg2+2.5mmol/L、引物0.3μmol/L,总体积25μL.运用该结果从208对引物组合中共筛选出扩增条带清晰,多态性丰富的SRAP引物27对.优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行三角梅遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础.     

濒危植物长柄双花木ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取长柄双花木(Disanthus cercidifoliusvar.longipes)基因组DNA,并以此DNA为模板,对ISSR-PCR的反应体系进行了优化,建立了适合长柄双花木ISSR-PCR的反应体系和程序,即20μL的反应体系中,含模板DNA20 ng,Mg2+2.0 mmol.L-1,引物0.25μmol.L-1,dNTPs 0.20 mmol.L-1,TaqDNA聚合酶1.0 U;扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,48~54℃复性45 s;72℃延伸90 s;共36个循环;循环结束后,72℃延伸7 min.本研究为利用这一分子标记对长柄双花木进行遗传多样性分析奠定了基础.