植酸酶基因表达与调控机制研究（Ⅱ）：番茄幼苗 …

采用异氰酸胍法从发芽３－４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ。     

缺铁玉米根cDNA文库的构建及蛋白和cDNA差异比较

采用异硫氰酸胍酚氯仿法分离铁胁迫玉米根总ＲＮＡ,然后采用寡聚ｄＴ 纤维素层析柱法纯化Ｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡ．用含有ＸｈｏＩ位点的ｌｉｎｋｅｒｐｒｉｍｅｒ 锚定合成ｃＤＮＡ 第一条链后,采用替代法合成第二条链,接着连接上ＥｃｏＲＩＡｄａｐｔｅｒ 以便定向重组到载体上．ｃＤＮＡ 经过ＸｈｏＩ消化和分级分离后,带有ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ粘性末端的ｃＤＮＡ 定向重组到λＺＡＰ表达载体的ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ位点上．经体外包装,重组的噬菌体转导宿主菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ,最终获得滴度为４－５ ×１０５ ｐｆｕ／ｕｇ 的λＺＡＰ 表达ｃＤＮＡ 文库．通过差异筛选法和质膜双向电泳验证了缺铁和加铁条件下ｃＤＮＡ 和质膜蛋白的差异     

猪垂体Poly（A）~＋RNA的制备及其体外翻译

本文用ＬｉＣｌ沉淀法提取了猪垂体总ＲＮＡ，经。ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ柱亲和层析，分离纯化了猪垂体Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ．用自制的兔网织红细胞体外翻译体系鉴定，表明该Ｐｏｌｙ／（Ａ）＋ＲＮＡ具有较高的翻译活性．ＳＤＳ－ＰＡＯＥ，放射自显影分析翻译产物提示，在制各的猪垂体Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ中，编码猪生长激素前体的ｍＲＮＡ占有较高的比例．     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ。重组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔａｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５端与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）编码基因融合,阳性重组子在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解上清液经ＧＳＨ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱一步纯化,能除去绝大部分杂蛋白,基本达到纯化的效果。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫杂交分析显示,重组表达产物确系人红细胞生成素受体     

经大肠杆菌感染的中国家蚕cDNA文库的构建

用建立非表达文库的方法,从大肠杆菌感染后９ｈ的中国家蚕的ｍＲＮＡ合成ｃＤＮＡ片段,重组入噬菌体λｇｔ１０的ＥｃｏＲＩ的位点之间,所构成的基因非表达文库库容量为２×１０６重组子,经大肠杆菌Ｃ６００与Ｃ６００ｈｌｆ菌株平皿测定,重组率为７６％．     

河田鸡线粒体DNA物理图谱

运用差速离心法、蛋白酶Ｋ及ＲＮａｓｅ消化法制备并纯化河田鸡（ＧａｌｕｓｇａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓＨｅｔｉａｎｂｒｅｅｄ）的线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）．用１１种限制酶对其进行单酶切分析,结果表明,ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ和ＳｔｕＩ在河田鸡ｍｔＤＮＡ上分别有５、２、４、５、１、３、４、３、３和＞９个酶切位点,Ｓｃａｌ在不同个体河田鸡ｍｔＤＮＡ上检测出两种限制性格局,分别有２和３个酶切位点．此外,还用ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ和ＳｃａＩ进行双酶切,构建了ｍｔＤＮＡ的物理图谱     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

与大豆叶片衰老相关的cDNA的克隆

植物叶片衰老是一个受遗传控制的细胞降解过程,最终导致叶片的死亡。一些研究结果已表明,蛋白酶基因的表达与叶片衰老过程相关,其中一些基因的表达具有衰老特异性。以半胱氨酸蛋白基因特异性引物和寡聚ｄＴ为引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增来源于绿叶和诱导衰老叶片ｍＲＮＡ的互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）,然后进行琼脂糖凝胶电泳,差异显示出一条衰老叶片样品所特有的ｃＤＮＡ带,将此ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。分析结果证明     

籼稻与粳稻品种间叶绿体DNA的RFLP差异

用ＥｃｏＲＩ与ＡｖａＩ对栽培稻的７个籼稻品种和４个粳稻品种进行叶绿体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）的ＲＦＬＰ分析，结果显示籼稻品种的ｃｐＤＮＡ具有较高的多态性，粳稻品种的则较为均一．另外，栽培稻的ｃｐＤＮＡ并无严格的亚种特异性．     

高等真菌LMPQ39基因文库的构建

以噬菌体λＥＭＢＬ３ＤＮＡ为载体，用ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ双切酶切后，与Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切的１０－２１ｋｂＤＮＡ片段连接，体外包装，感染Ｅ·ｃｏｌｉＬＥ３９２，所得重组子数为２．２１×１０４ｐｆｕ，超过建库所需的理论值．随机挑选的１４个克隆子，其ＤＮＡ用ＢａｍＨＩ酶切，有９个出现了不同于载体ＤＮＡ的酶切带型．     

红细胞生成素(EPO)在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中稳定表达

将ＥＰＯｃＤＮＡ分别插入真核表达质粒载体ｐＳＶ２ｄｈｆｒ和ｐｃＤＮＡ３的适当位点,用电脉冲法导入ＣＨＯ细胞,用ＥＬＩＳＡ法检测ＥＰＯ的表达量,用ＴＦ１细胞检测ＥＰＯ表达产物的生物活性．结果表明,用ｐＳＶ２ｄｈｆｒ作为载体,在抗ＭＴＸ阳性细胞克隆中,获得了表达ＥＰＯ（２５８ｎｇ／ｍＬ培养液）的ＣＨＯ细胞株,并且表达产物具有生物活性．进一步的传代和冻存试验表明,所得细胞株表达ＥＰＯ的水平不受传代和冻存的影响     

GHRP—scu—PA—32K突变体的构建,表达及纯化产物的部分性 …

在ｓｃｕ－ＰＡ３２Ｋ的ｃＤＮＡ分子基础上经定点突变,在Ｎ端紧接Ｌｅｕ＾１以前引入编码ＧＨＲＰ四肽的寡核苷酸序列（ＧＧＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴ）,构建了ＧＨＲＰ－ｓｃｕ－ＰＡ－３２Ｋ的突变体ｃＤＮＡ。将它克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ＾－细胞。筛选到的稳定表达株在无 清培养基的表达量为５８０ＩＲ／（１０＾６细胞．２４ｈ）。经锌离子螯合亲和柱纯化的产物,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示为一蛋     

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＣＰＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｅｒＳ２－Ｓ基因,并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中,构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒。重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后,瞬时转梁小鼠Ｌ细胞,ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达。用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,首次接种质粒ＤＮＡ３周后,血清抗体开始出现,再次加强２周后,阳性     

核酸的分子静电势（I）──C－DNA的分子静电势

对于序列聚（ｄＧ－ｎｒ）和聚（ｄＡ－ｄＴ）来说，本文介始了Ｃ－ＤＮＡ活性位置的分子静电势（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＥｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｌ）的计算方法和结果［１］．描述了双螺旋表面外壳（ＳｕｒｆａｃｅＥｎｖｅｌｏｐｅｓ）上势的分布，并将其与Ｂ－ＤＮＡ有关结果［２－４］作了比较．     

丝状蓝藻与大肠肝菌之间杂合质粒的构建与克隆

丝状蓝藻Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ的ｐＰｂ１经ＨｐａⅡ酶酶切与ＡｃｃＩ酶酶切的ｐＵＣ１３构成杂合质粒，杂合质粒克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９，频率为３．４％．转化进Ｅ．ＣｏｌｉＪＭ１０９的杂合粒，用ＥｃｏＲＩ和ＨｐａＩ酶切后得到证实。杂合质粒转化到新制备的Ｐ。ｂｏｒｙａｎｕｍ原生质球或丝状体后，再生的藻体表现高于原来两倍以上的ＡＰ抗性。利用ＡＰ每感的Ｅ．ｃｏｌｉ平板培养，证实了转化入藻体     

人红细胞生成素受体膜外结构域在大肠杆菌中的融合表达及其纯化

将插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ的人红细胞生成素受体ｃＤＮＡ,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶解,分离得到的基因片段,插入到经ＥｃｏＲＩ和ＲａｍＨＩ消解的表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ中,得到了重组表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ＨＥＰＯＲ。生组质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ／ｈＥＰＯＲ含有ｔｑｃ启动子,ＥＰＯＲ膜外结构域基因５’端与谷胱甘肽转移酶编码基因融合,阳性重组子在大肠村菌中经ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ｈＥＰＯＲ,重组表达菌裂解     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

人血小板生成因子（TPO）的cDNA克隆在小板生成效应

用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从人胎肝总ＲＮＡ中扩增得到约１．１ｋｂ人ＴＰＯ ｃＤＮＡ编码顺序，并进行分子克隆，将其中一个克隆（ｐＴＰＯ４７）亚克隆到Ｍ１３载体，测定全部ＤＮＡ顺序。它的碱基顺序与已报道的顺序完全相同，有一个１０５９ｂｐ的开放阅读框架可编码３５３个氨基酸。ｐＴＰＯ４７亚克隆到哺乳动物表达载体ｐＣＥＰ４，在哺乳动物２９３细胞系瞬时表达后，进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，结果显示有约１．４ｋｂ的转录产     

Ce离子对寡聚脱氧核苷酸的断裂作用

报道了Ｃｅ离子对人工设计合成的２６ｂｐ的单链ＯｌｉｇｏＤＮＡ的水解断裂作用．Ｃｅ（Ⅲ）需要有氧气存在的条件下,氧化生成Ｃｅ（Ⅳ）后才能切断ＯｌｉｇｏＤＮＡ,系统研究了各种条件下Ｃｅ（Ⅳ）对ＯｌｉｇｏＤＮＡ的切断反应,在酸性、碱性条件下都能水解切断ＯｌｉｇｏＤＮＡ,在近中性时切断作用最强。随着反应温度的升高、浓度的增大大反应时间的延长,切断反应越来越明显,并提出了反应机理,建立了用变性聚丙烯酰胺胺凝     

恶臭假单胞菌萘质粒I N L基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｇ７）携带的ＮＡＨ７，经限制内切酶ＥｃｏＲ１切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４．６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ＰＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ＰＫＡＯ质粒，此质粒经Ｈｐａ １，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚克隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱，绘制出内切酶图谱，从ＰＮＮ１质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎ