绵羊乳腺特异表达人肝细胞再生增强因子载体的构建及表达

用PCR技术分别从人和绵羊基因组DNA中扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration，hALR)基因和绵羊β-乳球蛋白(sheep beta-lactoglobulin，BLG)基因启动区序列，从pEGFP-C1质粒中扩增增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescence protein，EGFP)基因及其表达调控元件．由质粒p7zf( )构建成ALR基因乳腺特异表达、EGFP基因非组织特异性表达载体．同时体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(sheep fetal fibroblast cells，SFFCs)，脂质体介导载体DNA转染SFFCs，激光共聚焦显微镜观察和PCR检测转基因细胞，结果表明，增强绿色荧光蛋白基因在SFFCs中表达，转基因细胞中可扩增出BLG、ALR、EGFP基因条带．     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP，转染至培养的Hela细胞中成功表达，并发出绿色荧光，证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体的构建与鉴定

构建含有myc-KyoT2融合基因片段的病毒载体,并在真核细胞中表达鉴定.方法:由科室保存质粒分别酶切得到Plenti/V5、IRES2-EGFP和myc-KyoT2基因片段,分别将myc-KyoT2基因片段插入质粒pIRES2-EGFP得到myc-KyoT2-IRES2-EGFP,然后将myc-KyoT2-IRES2-EGFP基因片段插入质粒Plenti/V5-GFP,构建病毒载体Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,应用免疫印记和荧光显微镜检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达.获得了质粒myc-KyoT2-IRES2-EGFP和Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,myc-KyoT2融合蛋白和绿色荧光蛋白均正确表达.说明成功构建了含有myc-KyoT2-IRES2-EGFP融合基因的病毒载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础.     

禽类多瘤病毒APV-1晚期基因多顺反子的EGFP标记载体构建和表达

为研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译起始调控的机制,设计和构建了以增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因替代病毒APV-1野生型的晚期结构蛋白VPs基因的真核双顺反子表达载体,并观察其在转染进入禽类原代成纤维细胞中的表达翻译状态.以APV-1的c DNA克隆(p HL1003)为模板,运用PCR技术扩增出与野生型病毒APV-1相同的Ori区、早期编码区和晚期Agno-1a区序列作为载体片段;从质粒p EGFP-N1中扩增出编码绿色荧光的EGFP DNA片段;经连接构成重组质粒p HL1003-GFP,通过脂质体细胞转染方法将质粒DNA转染到鸡胚胎和鹌鹑胚胎成纤维细胞中,通过细胞培养观察荧光表达状况.DNA序列分析证实了重组克隆中的EGFP序列与已知的质粒p EGFP-N1中EGFP序列一致.转染72 h后观察鸡和鹌鹑胚胎成纤维细胞,转染成功胚胎细胞明显表达较强的荧光,说明GFP可以在构建的双顺反子重组质粒的下游中正常表达并产生荧光.p HL1003-GFP重组质粒的构建及其在禽类原代成纤维细胞中的高效表达,为我们研究多顺反子翻译起始调控中Agno-1a基因的表达对下游病毒结构蛋白基因的翻译调控机制提供了简洁易用的系统和模型.     

高效转染HepG2细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

为构建含绿色荧光蛋白(EGFP)和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达,将IRES-EGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体(pLXSN-GI-Ins)中,构建得到表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有30.0 mmol/L葡萄糖的培养液继续培养24 h,在荧光显微镜下观察EGFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值.数据显示,成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSN-GI-Ins-EGFP.转染HepG2细胞后48 h,表达EGFP基因的细胞数目占总细胞数目的比值为(38.0±5.0)%.结果表明,构建了含EGFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体,并且能够在HepG2细胞中成功表达.     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

绿色荧光蛋白标记S2P在集胞藻6803中的表达

为研究集胞藻6803中两个S2P同源蛋白酶Slr0643和Sll0862的功能,分别在两个蛋白酶的羧基端添加增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签,构建了两株转基因集胞藻psbA2::0643GFP-Cmr/△0643-Kmr和psbA2::0862GFP-Cmr/△0862-Kmr.通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测到egfp基因的转录表达,通过激光共聚焦显微镜检测到转基因集胞藻细胞发出的绿色荧光蛋白荧光,表明带EGFP标签的S2P融合蛋白在psbA2启动子调控下正确表达.     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA，利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因，将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中，构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene，EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene，ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR，并将其转染Hela细胞系，用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞，然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达，用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体；在转基因细胞中，PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带，蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符；荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中，EGFP和ALR同时存在并表达，绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达，从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

早期肺癌病人血液中P53的克隆及其pEGFP-N1-p53的构建

首先用RT-PCR方法从早期肺癌病人的外周血中克隆出人抗癌基因p53,经测序确认为野生型后,通过酶切、连接、转化构建出扩增质粒pMD18-T-p53,然后构建出含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒pEGFP-N1-p53.pEGFP-N1-P53经限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切,酶切产物电泳结...     

结核分枝杆菌mpt64基因真核表达载体的构建及表达

构建结核分枝杆菌分泌蛋白mpt64基因真核表达载体。通过PCR法从MTBH37Rv株基因组中扩增mpt64基因，插入pGEM-T-easy载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-），重组质粒酶切鉴定正确后，以Lipo-fectamine2000转染COS-7细胞后，分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。构建了真核表达载体pcDNA-mpt64，RT-PCR结果证明mpt64基因可在COS-7细胞中转录，用间接免疫荧光检测，有表达mpt64蛋白的细胞着染。结果表明，构建结核分枝杆菌mpt64基因的真核表达载体pcDNA-mpt64成功，mpt64基因可以在COS-7细胞中表达。     

DLL3蛋白在人小细胞肺癌细胞中的功能及其机制

为探讨DLL3(human notch ligand delta-like 3)过表达对人小细胞肺癌细胞的影响及可能的作用机制,通过PCR方法扩增人DLL3基因全长序列,并克隆至慢病毒表达载体Lenti-EFS-FLAG-puro而构建人DLL3基因过表达慢病毒表达质粒,酶切及测序鉴定质粒正确。通过慢病毒包装及感染,构建DLL3稳定过表达的人小细胞肺癌细胞株,并通过Western blot验证DLL3蛋白的表达。采用CCK-8法检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖的影响。采用平板克隆实验检测DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的克隆形成的影响。Western blot检测DLL3过表达对细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平的影响。结果表明:人DLL3过表达慢病毒表达质粒构建成功; CCK-8实验显示DLL3过表达促进人小细胞肺癌细胞的增殖。平板克隆实验显示DLL3过表达提高人小细胞肺癌细胞的克隆形成能力。Western blot结果表明DLL3过表达增加细胞周期蛋白Cyclin D1,Cyclin D3的表达水平。可见DLL3过表达对人小细胞肺癌细胞的增殖具有促进作用。     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

hTR基因反义表达质粒构建及序列分析

从人的脐带血管内皮细胞中提取基因组 DNA,通过 PCR方法扩增得到了人端粒酶RNA成分 ( human telomere RNA,h TR)的基因片段 ,扩增产物经酶切克隆到逆转录病毒载体p LNCX上 ,构建了 h TR基因的反义表达质粒 .序列分析结果表明 ,PCR扩增得到的 h TR基因的 DNA序列与所发表的序列完全一致 .构建的反义表达载体中的目的基因正确地反向插入到逆转录病毒载体 p LNCX的克隆位点上 ,构成了 h TR基因的反义表达质粒     

通用型奶牛多位点基因打靶载体系统的构建

以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶I-SceI切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,将部分解决目前存在的打靶效率低、安全性差等问题.     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.     

猪脑心肌炎病毒VR-129 B株VP2重组蛋白的构建表达及其免疫活性分析

为获得大量猪脑心肌炎VP2基因及蛋白研究的细胞模型,构建pDC315-EMCV-VP2真核表达载体,且将其转染到293T细胞,筛选出阳性质粒进行克隆。EMCV VR-129B株VP2基因序列参照GenBank(登录号:X74312),利用RT—PCR方法扩增VP2的全基因序列,将其与质粒pDC315经NheI和XhoI双酶切后连接,构建pDC315-EMCV-VP2重组表达质粒,并将其转染至293T细胞。使用荧光定量PCR方法观察pDC315-EMCV-VP2真核表达载体在细胞中的表达情况。双酶切PCR结果获得大小为780 bp的基因片段,测序结果显示与GenBank上已经公布的同名基因(登录号:X74312)序列片段同源性为100%,重组质粒构建成功。实时荧光定量PCR(QPCR)结果显示,重组质粒转染组与空质粒组之间相比,EMCV-VP2基因的表达量显著上调(P0.001);在荧光显微镜下观察转染细胞,转染成功部分出现较亮绿色荧光,EMCV-VP2基因表达稳定。从转染细胞中提取重组蛋白与EMCV阳性血清和阴性血清进行ELisa反应,具有较好免疫活性。     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。