大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

短尾蝮蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶A_2的分离纯化及磷酸化修饰检测

利用阴离子层析、凝胶排阻色谱和反相高效液相色谱从短尾蝮蛇毒中分离金属蛋白酶和磷脂酶A2,用蛋白印迹法检测两种组分的磷酸化修饰信号,结合LC-MS质谱鉴定并预测磷酸化修饰位点.结果表明,利用3种色谱法串联组合,最终分离获得两种条带单一且纯度高的短尾蝮蛇毒蛋白,经LC-MS质谱鉴定分别为蛇毒金属蛋白酶和磷脂酶A2.免疫印迹检测发现这两种蛇毒蛋白受到明显的磷酸化修饰,解析质谱图发现蛇毒金属蛋白酶有4个氨基酸位点受到潜在的磷酸化修饰(含1个丝氨酸和3个苏氨酸),磷脂酶A2仅有1个酪氨酸位点受到潜在的修饰.所得结果是磷酸化位点修饰抗体在蛇毒蛋白磷酸化修饰信号检测中的一次尝试,基于修饰位点的预测可为蛇毒蛋白功能受磷酸化修饰影响的研究提供基础.     

StyS激酶自磷酸化对Pseudomonas putida B3中靛蓝生物合成的调节作用

在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida B3中,靛蓝生物合成关键酶基因styAB上游存在一个二元调控系统StyS-StyR。StyS蛋白属于激酶家族,是磷酸化信号转导的重要媒介,但激酶StyS的自磷酸化传导机制对靛蓝生物合成的调节作用尚未探明,因此,研究以Pseudomonas putida B3中激酶蛋白StyS作为研究对象,发现了两个磷酸化结合位点,构建了磷酸化位点突变株。通过分析野生菌株P. putida B3、styS基因缺失菌株P. putida B3-ΔstyS、styS基因回补菌株P. putida B3-ΔstyS-8和磷酸化位点突变株P. putida B3-ΔstyS-1之间的靛蓝产量及酶活发现,P. putida B3产量为10.14mg/L,P. putida B3-ΔstyS-8产量为3.63mg/L,磷酸化位点突变菌株无激酶活性且失去了产生靛蓝的能力。结果表明,StyS自磷酸化作用在靛蓝发酵体系中起重要作用。研究结果将为靛蓝生物合成途径的进一步研究提供参考。     

卷枝毛霉苹果酸转运蛋白生物信息学分析

借助生物信息学技术预测分析卷枝毛霉苹果酸转运(malate transporter, MT)蛋白的理化特性、空间结构及功能位点,通过Protpara、PredictProtein、TMHMM Server、NetPhos等在线分析工具对MT蛋白的基本性质和结构进行分析预测。结果表明,MT蛋白疏水性强且性质稳定,属于非分泌型蛋白,由10个跨膜螺旋逆时针排列形成一个接近于椭球形的蛋白质分子三维结构;该转运蛋白有8个豆蔻酰化位点,3个ASN-糖基化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点;系统发育分析发现,卷枝毛霉MT蛋白与毛霉菌(Mucor ambiguous)的同源性最高,聚为一类,与植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的亲缘关系较远。本研究为后续探究苹果酸转运蛋白的三维结构与功能奠定了基础。     

水稻BpHi008A基因对褐飞虱取食应答及其编码产物在大肠杆菌中的高效表达

对抗虫相关蛋白BpH i008A进行了生物信息学分析,发现BpH i008A含有一个PKC磷酸化位点、一个CK2磷酸化位点、三个N-myristoylation site位点;另外,BpH i008A蛋白含有一跨膜螺旋,和位于细胞内的N-末端及伸向细胞外的C-末端.Northern分析证明褐飞虱的取食是维持BpHi008A基因的表达的必要条件.以pET28 a为载体构建了非融合表达的重组质粒,并且实现了BpHi008A基因在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的高效表达.     

东亚飞蝗气味结合蛋白Ⅰ的生物信息学分析

利用生物信息学方法分析了东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)OBP1的核苷酸与氨基酸序列(GenBank登录号FJ215322.1/ACI30696.1),并对其组成成分、疏水/亲水区域、信号肽、跨膜结构域、蛋白质二级结构,以及分子进化关系等进行了预测与推断.结果显示,该蛋白由148个氨基酸组成,预测相对分子质量为16 122.6,理论等电点(pI)为4.99,分子式为C696H1128N184O223S15;含有蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点等;具有标准的昆虫信息素/气味结合蛋白结构域.     

人类病毒蛋白质磷酸化修饰位点的识别研究

蛋白质磷酸化翻译后修饰在病毒的复制和抑制宿主细胞功能方面发挥重要的作用。然而,利用实验的方法识别磷酸化位点既费时费力又耗财。因此基于蛋白质氨基酸序列发展一种机器学习方法对病毒蛋白磷酸化位点进行预测显得非常有必要。研究结合支持向量机提出识别病毒蛋白磷酸化位点的新方法。采用权重氨基酸成分和属性分组编码对病毒蛋白残基的氨基酸物理化学性质和序列信息进行特征提取,通过10倍交叉验证,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的预测准确率分别达到82.0%、85.8%和92.4%。运用该预测模型对丝氨酸残基磷酸化的激酶组进行分类评估,CMGC、AGC和CAMK激酶组的马氏相关系数分别达到69.3%、68.8%和68.2%。结果表明:构建的方法可以有效地预测激酶特异性的磷酸化位点。     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

多房棘球绦虫钙网蛋白结构和功能的生物信息学研究

为进一步研究多房棘球绦虫的致病性、药物靶点以及疫苗诊断试剂的开发提供理论依据,应用生物信息学方法预测分析多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的结构和功能。通过基因组数据库收集数据确定Em-CRT基因和氨基酸序列;利用生物信息学软件分别对Em-CRT进行蛋白质基本性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二/三级结构、亲/疏水性、抗原表位以及进化关系等进行预测和分析。结果表明:Em-CRT基因转录本长度为1 188 bp,蛋白全长为395个氨基酸残基,分子量大小约为45.44 kDa,等电点(pI)为4.47,为稳定蛋白,亲水性较高,可溶于水;具有信号肽和信号肽酶剪切位点,为膜外蛋白;Em-CRT具有N端糖基化位点,酪氨酸激酶(TK)Ⅱ磷酸化位点,cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,N端肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主;Em-CRT具有良好的T,B细胞抗原表位。所以,Em-CRT对多房棘球绦虫个体发育具有重要的作用,且与多房棘球蚴感染免疫密切相关,可参与感染过程或宿主免疫应答,具有作为诊断试剂抗原分子的价值和潜在的疫苗候选分子与新的药物靶标的应用前景。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

家蚕中一未知基因的生物信息学分析

对家蚕中一未知基因进行生物信息学分析,结果显示：该基因开放阅读框大小为858bp,编码285个氨基酸,预测分子量为31．1kD,等电点为4．75;该基因编码蛋白含有TPR（Tetratrico Peptide Repeat）结构域,具有个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、肉豆蔻酰基化位点、糖基化位点及cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化功能位点。     

维生素E对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化的保护

通过免疫印迹，酶活性测定等方法在脑片水平研究维生素E(VE)对花萼海绵诱癌素(cA)诱导的骨架蛋白tau过度磷酸化的保护作用及机制．结果显示：01tmol／LCA使tau蛋白在Ser396／404，Serl98／199／202位点的磷酸化程度显著升高，丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(s0D)活性显著升高；VE能使tau蛋白上述位点的磷酸化水平显著降低，同时降低CA诱导的vH)A含量的升高及进一步升高SK)D的活性．提示CA不仅能够在脑片水平诱导tau的过度磷酸化，同时诱导氧化应激反应；vE对CA诱导的氧化应激反应及tau蛋白过度磷酸化具有保护作用．     

沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的分子进化

运用生物信息学分析手段和在线数据库,对沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因进行综合分析。结果显示:该基因全长为1 562 bp,开放读码框为1 152 bp;编码383个氨基酸,分子量为44 010.5道尔顿;等电点为8.63,带正电荷侧链的氨基酸与带负电荷侧链的氨基酸比例为29∶34;氨基酸组成中亮氨酸占10.7%,缬氨酸占7.8%,丙氨酸占6.8%;不稳定指数为36.73,脂肪指数为89.58,总平均疏水指数为-0.016,为亲水蛋白;其二级结构以无规则卷曲与折叠为主,属膜蛋白,有3个酪氨酸激酶II磷酸化位点、2个N-肉豆蔻酰化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、3个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个微体C-端定位信号;该蛋白为质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族蛋白(Membrane-FADS-like superfamily)。功能预测分析结果显示与其他物种的该去饱和酶特性相一致。     

拟南芥信号传递途径

探讨拟南芥发育过程中一些调控基因表达的信号是如何传递的。广泛查阅近期有关发育生物学方面的文章,综述了拟南介信号传递的过程。发现植物体有许多与动物相同的信号传递途径,如磷酸化级联途径。在拟南芥中Raf1激酶,蛋白激酶（MEK）、蛋白激酶激酶（MAPK）都与信号转导直接有关。另外发现磷酸化过程在一定程度上依赖于卷须蛋白（CLV1）的自动磷酸化。植物信号转导途径类似于动物,通过磷酸化作用传递各种信号,来保持细胞增殖和分化的平衡。     

DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1（TopBP1）磷酸化功能位点推测及功能分析

为阐明DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)参与DNA损伤修复应答的分子机制，本研究通过生物信息学分析，发现多个潜在的TopBP1磷酸化位点T860，S887，T1104及T1167，利用分子生物学手段从人cDNA文库中扩增并获得TopBP1克隆质粒，将上述磷酸化位点突变为丙氨酸，观察突变质粒转染细胞对DNA损伤修复的应答反应. 结果显示，在粒子射线照射或化疗药物处理细胞后，第1104丙氨酸突变（T1104A） 的TopBP1蛋白导致pRPA32-S33的磷酸化水平大幅降低，同时细胞周期检验点失活，严重阻滞了DNA应激反应，证实T1104是TopBP1参与DNA损伤修复的关键活性位点.     

绵羊KAP1.1基因编码蛋白生物信息学分析

为了探究KAP1.1基因(keratin-associated protein 1-1)潜在的生物学功能,利用分子生物学软件对绵羊KAP1.1基因编码蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,该基因共编码182个氨基酸,为一可溶性不稳定蛋白。分子量为18 788.45 u,等电点为6.03。另预测得知该蛋白含有6个磷酸化位点,无糖基化位点,不含有跨膜区和信号肽,推测其不是一个分泌型蛋白。亚细胞定位绵羊KAP1.1蛋白主要在线粒体和细胞核中发挥生物学功能,二级、三级结构显示,无规则卷曲是构成该蛋白的主要结构元件。物种间同源性分析显示,绵羊KAP1.1蛋白氨基酸组成与牛的相似度最高(85.9%)。     

rhIL-7生物信息学分析及原核系统分泌表达

通过生物信息学分析并预测hIL7糖基化位点、磷酸化位点、信号肽预测、跨膜蛋白、亲疏水性,构建pGEX-4T-1-hIL-7原核表达载体,转化至大肠杆菌LB21(DE3),优化hIL-7表达条件,利用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定重组蛋白.表明hIL-7与猴的同源性一致,是一个含有13个磷酸化位点及3个糖基化位点,具有信号肽的亲水性分泌蛋白.重组载体经DNA测序,显示包含正确的hIL-7编码序列.将pGEX-4T-1-hIL-7重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导表达融合蛋白(含GST标签),相对分子量约为43 000 Da,表达形式为包涵体表达.采用单因素方法对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行考查.在此基础上进行3因素3水平正交实验的统计学优化,得到的最优表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度0.5 mmol/L.     

CDK1磷酸化修饰对驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性的影响

为了探究真核细胞中蛋白激酶CDK1的磷酸化修饰对驱动蛋白分子Kif18A的ATP酶活性的影响,利用昆虫杆状病毒表达系统,在体外表达并纯化Kif18A模拟磷酸化(EE)和非磷酸化(AA)的突变体蛋白(Kif18A-EE,Kif18A-AA).首先构建驱动蛋白Kif18A的杆状病毒表达载体质粒pFast-Bac-FLAG-Kif18A-AA或EE,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆.随后提取杆状病毒基因组,转染昆虫细胞SF9后得到能够表达FLAG-Kif18A突变体蛋白的杆状病毒.扩增病毒后,对病毒感染SF9细胞表达目的蛋白的条件进行优化,最终通过蛋白纯化得到有活性的Kif18A突变体蛋白,并在体外检测纯化蛋白的ATP酶活性.结果显示,Kif18A-EE蛋白的ATP酶活性低于Kif18A-AA蛋白.这一结果表明,CDK1的磷酸化修饰能够降低驱动蛋白Kif18A的ATP酶活性.     

决策树算法预测人类病毒的蛋白质磷酸化位点

本文基于决策树分类算法构建人类病毒蛋白质磷酸化修饰位点的预测模型。采用氨基酸物理化学性质对蛋白质序列进行特征提取,并分析丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点邻近序列的氨基酸性质。同时考察了不同分类算法对预测结果的影响。通过10倍交叉验证,利用决策树算法预测丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的MCC分别达到77.31%、75.91%和71.94%,表明本文提出的方法能有效地预测人类病毒的磷酸化修饰位点。     

基于 LibSVM 的 CKSAAP 蛋白特征提取预测水稻蛋白质磷酸化位点

本文从swiss-prot中选取经过试验验证的水稻蛋白质磷酸化位点数据作为训练集合，应用蛋白质序列特征提取方法Composition of k-spaced residues pairs （CKSAAP），为利用SVM算法构建专门针对水稻蛋白质磷酸化位点的预测工具做准备。 CKSAAP方法利用在序列片断中残基的K个间隔距离的组成，进一步反映了残基之间的相关性。本文利用LibSVM软件包对已通过改进过得CKSAAP方法特征提取出来的数值特征对磷酸化位点进行预测，从而为之后构建水稻蛋白质磷酸化位点的预测工具做准备。结果表明，本文基于SVM和CKSAAP方法的水稻蛋白质磷酸化位点预测在丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的平均预测准确性为80．638％，马修斯系数为0．611。与PlantPhos和Musite的预测性能的对比结果显示，在磷酸化各氨基酸位点的预测性能高于PlantPhos及Musite。