杆状病毒AcMNPVie0/ie1启动子区域甲基化对自身调控作用的影响

对杆状病毒ie0/ie1启动子区域甲基化测序和甲基化特异性PCR,发现ie0区域甲基化程度较高,且随着感染过程发生变化,在感染后8h有明显下降.为了研究启动子区域内甲基化对其活性及表达调控的影响,构建了表达AcMNPV极早期蛋白IE0和IE1的质粒p402-ie1、p402-ie0M-A及报告质粒pie0p-luc、pie1p-luc,采用体外甲基化的方式,研究DNA甲基化对IE0、IE1调控自身启动子作用的影响.结果证实ie0p受IE0蛋白激活,而受到IE1蛋白抑制,发现DNA甲基化极大降低ie0p、ie1p活性.验证了IE0、IE1蛋白对于ie1p的激活作用,而甲基化后IE1/IE0对其激活作用依然保持.不同比例的p402-ie1/p402-ie0M-A转染实验,发现在IE0IE1时,甲基化能够逆转IE0/IE1对于ie0p的调控作用.这些结果表明,DNA甲基化状态可以影响杆状病毒IE0和IE1蛋白对ie0启动子对基因表达的调控.     

几种诱导昆虫细胞RNA干扰质粒的构建和效果比较

构建了四种可以在昆虫细胞中表达形成dsRNA的质粒,比较了其诱导RNA干扰,抑制目标基因———绿色荧光蛋白(GFP)基因表达的效果.四种质粒都不同程度地抑制了质粒介导的GFP表达,其中尤以单个果蝇hsp70启动子表达反向重复序列,并带有杆状病毒AcMNPV增强子hr5的质粒效果最佳,使GFP表达量下降到原来的3.9%.当用于抑制由杆状病毒介导的GFP表达时,以两个相向排列的AcMNPV ie1基因启动子的构造有明显的抑制效果.这些结果对于在昆虫细胞中有效地利用RNA i研究基因功能有参考意义.     

DNA甲基转移酶抑制剂DAC对AcMNPV感染的影响

通过DNA甲基转移酶抑制剂DAC(地西他滨,decitabine)改变DNA甲基化水平,研究杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)DNA的甲基化与病毒复制和基因表达调控的关系。通过流式细胞术和病毒mRNA的Real-time PCR检测发现,低浓度DAC(30nmol/L)处理细胞后会使报告基因绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein gene,gfp)的表达提前,且表达水平明显上升。对低浓度DAC处理组和对照组产生的病毒效价监控表明,低浓度DAC的存在可以提高病毒的效价。经连续DAC处理,在第六代细胞中生产的AcMNPV多角体感染甜菜夜蛾后,幼虫死亡率明显高于对照组。这些结果表明,DAC对杆状病毒DNA复制和基因表达具有一定作用。     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响

POLD1基因编码DNA聚合酶δ(polδ)的催化亚基.体外实验表明p53能够抑制POLD1基因启动子活性.文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达.在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中,p53表达增强;RT-PCR结果显示POLD1基因mRNA表达受到抑制.染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性.荧光显微镜观察发现EGFP-p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质.在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中,细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平.证明了细胞内p53高表达后通过直接与POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达,且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响.     

G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控

POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.     

AcMNPV p95基因一段339 bp序列在病毒复制中的作用

杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的p95基因编码的P95蛋白是病毒核衣壳的组成部分,也是虫体经口感染相关因子PIF(Per os Infectivity Factor)复合体的组成部分.前期研究表明,完整的P95蛋白对病毒的复制是非必需的,其中一段450bp的序列可以部分弥补p95基因的作用.本研究将p95基因一段339bp的片段(Core339,AcMNPV基因组位置:69 576~69 914bp)以正反两个方向分别插入到p95基因敲除的AcMNPV基因组中多角体位点的polyA之后,构建了两株重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-.该两株病毒能在Sf9细胞中正常复制,复制水平与p95基因正常的AcEGFP相当,但复制速度较慢.重组病毒感染细胞的Western blot分析未检测到P95蛋白的表达.这一结果表明P95蛋白的缺失对病毒在细胞中的复制没有显著影响,但核心片段Core339对于病毒复制具有关键作用.     

AcMNPV polh启动子上游增强序列的部分缺失分析

本实验构建了2个用于杆状病毒AcMNPV(苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒)启动子及其调控序列研究的质粒载体:pF SBCAT和pF SBCATPpolh.以此为基础,结合目前对BmNPV(家蚕核多角体病毒)polh(多角体)基因和AcMNPVpolh基因上游增强序列的研究结果,构建了AcMNPVpolh基因上游增强序列部分缺失的瞬时表达载体;以cat为报告基因,利用瞬时转染和CATELISA的方法检测报告基因的表达活性,初步研究了对于polh启动子具有增强作用的AcMNPVpolh基因上游序列的结构.结果显示,与BmNPVpolh上游293bp序列同源性极高的AcMNPVpolh上游293bp片段对于polh启动子没有增强活性;CMVm启动子的AcMNPVpolh上游增强序列部分缺失之后不能够增强AcMNPVpolh启动子.因此,这一序列可能不再被缩短,也不大可能存在独立地起作用和更短的正、负调控元件.     

AcMNPV bro基因的表达和作用研究

bro基因(baculovirus repeated orf)是杆状病毒编码的一个独特的基因家族,一些病毒的基因组中编码有多个该基因家族的成员.研究分析了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组仅有的一个bro基因,结果表明:AcMNPVbro基因(ac-bro)在感染后6h就开始转录,并在8h时检测到BRO表达;ac-bro基因敲除的重组病毒感染后子代病毒的效价略低于野生型病毒,且其DNA复制明显推迟.利用大肠杆菌中重组表达的Ac-BRO蛋白进行的体外实验提示其具有结合DNA的能力.这些结果提示ac-bro基因在病毒的复制中有一定的作用.     

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性.TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.     

老年人生活空间移动性影响要素研究进展

 老年人生活空间移动性是老年人在日常生活中能动生活状态的重要表征。在梳理老年人生活空间移动性相关概念、测度方法基础上，分析了物质环境要素和非物质环境要素对老年人生活空间移动性的影响；提炼出有效支持老年人生活空间移动性的中观环境规划、微观环境设计和政策文化扶助层面的策略；指出了老年人生活空间移动性的研究建议和发展方向。     

民间法正义观的转型

研究了国家法的抽象正义观与民间法的情理正义观,认为西方国家法的抽象正义观与东方民间法的情理正义观存在实质的不同,原因在于思维方式、超验与经验传统、政治结构的差别。在现代法治理念下,传统民间法所代表的正义观将向混合正义观转型,西方法治所代表的国家法抽象正义观是其骨架。     

关于农业区划地图集中的统一协调问题

图集的统一协调,对图集质量有很大影响。本文是作者在编制北京市农业区划地图集的实践基础上,根据地图信息传输论的观点,对农业区划地图集的统一协调的内容及方法进行了探讨。试图总结编制这类图集的统一协调模式,以供读者编图时参考。     

发动机转动惯量的实验测定

发动机转动惯量是发动机系统动态模型的一个重要参数,一般需要通过试验测取发动机转速衰减曲线,再由曲线拟合而得。在文中提出一种试验曲线的全程拟合法,比以往的标定转速点拟合法可以取得更高的精度。     

关于一维非自治时滞系统点态退化的例子

给出了一维非自治时滞系统点态退化的几个例子。     

辽阳职业技术学院高尔夫学院发展现状研究

采用问卷调查法、文献资料法、数理统计法对辽阳职业技术学院二级分院高尔夫学院成立三年来招生、专业设置、教师队伍与实习实训等现状进行深入调查与分析,结果表明:在招生方面,高尔夫学院目前还未能得到家长的充分认可,招生人数不多;专业设置单一,实践教学及社会服务能力薄弱;实习实训条件较好,但仍需进一步完善;教师队伍建设相对滞后.针对上述情况,给出促进高尔夫学院稳步发展的建议.     

整数幂的和计算中的一些规律

给出整数幂的和的另一种计算公式的方法.     

膨胀土路基沉降的可靠度分析

针对膨胀土路基沉降的不稳定性和随机性等特点，以膨胀土的膨胀率、线收缩系数、初始含水量、工后沉降期始末的孔隙比变化量和固结度变化量、工后沉降期末的含水量等为基本变量，提出了膨胀土路基沉降的可靠度分析方法和可靠度指标的迭代计算步骤，并就具体工程实例进行了膨胀土路基沉降可靠度计算．结果表明按强度和稳定性设计原则设计的路基的工后沉降超过容许沉降的失效概率较大。     

接受美学的期待之路——读者接受与文学的创新

文学发展的动力之一在于创新。在接受美学诞生之前,学者们往往从作家的角度讨论文学创新问题。本文用接受美学的理论探讨文学创新的问题。笔者将文学创新的标准与读者接受相结合,就创新的三个方式与期待视野的方法论进行了初步的探讨。最后得出的结论是:读者期待视野的提高是作家作品创新的主要依据,作家在文学创作中应该充分考虑读者的接受才能做到创新。     

曲面“侧”概念的“参照物”理解法

曲面“侧”是一个重要而难以理解的概念 ,本文对曲面“侧”概念的讲授方法进行了探讨 ,给出了曲面“侧”概念的“参照物”理解法 ,通过实践证明 ,效果良好。