提取大肠杆菌(E.coli)质粒DNA的一种简便方法

在重组DNA或遗传工程的研究工作中,如果有一种快速而简便的提取质粒DNA的方法,这将使工作的开展方便得多,而且工作速度也可以大大加快。下面叙述的是根据一个微量鉴定转化子质粒DNA的方法,加以改进而成为较大量提取质粒DNA的新方法。     

一种简便快捷的植物线粒体质粒DNA的提取方法

介绍了一种从植物材料中提取线粒体质粒DNA的方法,该方法不需要密度梯度离心和有机溶剂油提,整个提取过程可在较短时间内完成,该方法简便,快捷,效果好,对拷贝数低的线粒体质粒DNA得率高。     

碱裂解法提取质粒DNA方法的改进

对碱裂解法提取质粒DNA的方法进行了一些改进 ,在室温下裂解菌体和变性DNA ;用NH4 Ac和LiCl同步沉淀除去样品中的蛋白质和RNA ,降低了对超螺旋质粒的剪切作用 ,得到高质量的质粒DNA。     

质粒DNA提取方法的研究进展

目前质粒DNA的提取方法有很多,本文综合阐述及比较了几种方法的利弊,试验证明异丙醇提取法所得质粒DNA浓度和纯度都很高,简便、快速,重复性好,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要,适合大多数实验室使用。     

大肠杆菌质粒DNA不同提取方法的比较

实验采用简化的碱法少量提取法、简便快速的煮沸法及试剂盒法提取质粒 p CB30 2 -3.并通过一对特异引物对质粒 DNA进行 PCR(聚合酶链式反应 )扩增 ,分别对各种方法所提取的质粒 DNA及其 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果表明碱法少量提取法和试剂盒法所提取的质粒 DNA纯度和产量高 ,且重复性好 ,达到了分子生物学实验要求 .其中简化的碱法少量提取法具有结果稳定和经济的特点 ,非常适合大多数实验室使用 .     

一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法

依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.     

一种高效安全提取质粒DNA方法的建立

在碱裂解法提取质粒DNA的基础上做了改进,将NaOH浓度从0.20 mol/L降低为0.10 mol/L,使得超螺旋DNA的得率进一步提高.采用silica法纯化质粒DNA,避免了使用有毒性和挥发性气味的饱和酚和氯仿,使得操作更安全简单.电泳结果表明,提取的质粒DNA质量好,得率高,并且可以直接进行下一步的酶切、连接及转化等实验.同时,该方法中使用的硅胶可以回收再生进行重复利用,节省了实验费用.     

几种农杆菌质粒DNA提取方法的比较

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法，得率较低，一般在50ng／uL以下。就经典的碱裂解法(方法一)和在碱裂解法的基础上改进的方法二(去除了酚、氯仿提取过程，减少了提取过程中对人的伤害，且缩短了提取时间)以及改进的方法三进行了比较，实验结果表明：改进的方法二更适宜于做PCR检测，而方法三则适合于重组质粒DNA的酶切、PCR鉴定等。     

一种快速提取致癌农杆菌(Agrobecterium tumefaciens)Ti质粒的方法

本文比较了前人提取致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的方法,改变了溶菌的条件和蛋白质除去的程序,找到一种简易、快速、重复性高的提取Ti质粒的方法。本文的方法是将一份致癌农杆菌细胞同四份碱性SDS溶菌液(pH12.6)混合,这样溶菌液的pH为10.5,然后将此碱性溶菌液(pH10.5)置37℃保温30分钟。为了有效地提取Ti质粒又改变了去除蛋白质的程序,溶菌液首先用苯酚—氯仿抽提,随之加5M NaCl于溶菌液中,使NaCl最终浓度达0.6M,溶菌液于冰水中盐析2小时,悬浮的溶菌液经高速高心,大部分蛋白质和变性DNA被除去,DNA提取液由混浊变清。这种方法也可以用于提取其它菌株中的小分子质粒。     

一种快速的重组农杆菌PCR鉴定方法

建立一种快速的重组农杆菌PCR扩增鉴定方法,采用煮沸法处理重组农杆菌,使农杆菌高温裂解,释放质粒DNA,直接进行PCR扩增反应,检测目的基因片段.结果表明,重组质粒PCR扩增效果较好,目标条带较为明显.通过煮沸重组农杆菌,进行PCR扩增反应鉴定质粒DNA,不仅实验操作简单安全,缩短实验时间,并且避免了酚、氯仿试剂在提取质粒DNA过程中的残留对后续分子鉴定质量的影响.     

酵母质粒的快速提取法

早期制备酵母2μm质粒的方法多是采用机械破碎细胞,所得到的质粒DNA中含染色体DNA碎片较多,得率也不高。Cameron和Devenish采取碱裂解法要求严格控制溶液pH值在12.45,因之不易操作,使此法运用受到限制。近年来,有人采用先提取酵母总DNA,再以酸酚法抽提质粒,仍然要求严格地保持提取液的pH值。用微量快速提     

不同试剂盒提取质粒中内毒素水平的比较

目的比较几种不同质粒提取试剂盒提取质粒中内毒素水平。方法选用6种市售商业化试剂盒:QIAGEN质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit(12123),QIAGNE无内毒素质粒大提试剂盒EndoFree PlasmidMaxi Kit(12362),康为世纪高纯质粒中提试剂盒(CW0502),A厂家无内毒素质粒中提试剂盒,B厂家无内毒素质粒小提试剂盒,C厂家无内毒素质粒小提试剂盒(BSC01S2D)。分别提取质粒DNA,应用鲎试剂显色基质法和凝胶法检测所提质粒中内毒素水平。结果6种试剂盒提取质粒得率、A260/A280及A260/A230值均较好,但内毒素水平各不相同,其中各厂家标明无内毒素试剂盒提取质粒中内毒素水平相对较低,QIAGEN无内毒素质料大提试剂盒提取的质粒中内毒素小于0. 125 EU/μg。结论6种质粒提取试剂盒使用时应根据实际情况进行选择。     

农杆菌质粒DNA高效提取方法研究

以EHA105菌株为实验材料,通过优化质粒扩增条件、加大菌液使用量、改良提取纯化过程中所用试剂等,简化了操作流程,给出了一种高效提取农杆菌中质粒DNA的方法。结果表明,选择LB＋KANA为培养基、抗生素质量浓度为50 mg/L,细菌培养至OD600=0.634～0.714时,以5 mL/次用量取菌液裂解;以改进方法提取试剂,得率与常规方法相当。该方法在满足PCR检测条件的前提下既减少了酚、氯仿等有毒试剂的用量,又省时、经济、方便,为植物转基因工程中目的物DNA的检测提供了技术支持。     

质粒pcDNA3.1-IL-24的制备和纯化

探索基因治疗用质粒pcDNA3.1-IL-24的规模化制备和纯化工艺。碱性裂解提取质粒后,以异丙醇和LiCl沉淀法去除大分子RNA。然后,使用DEAE Sepharose FF离子交换层析去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。经本工艺纯化的质粒pcDNA3.1-IL-24浓度为727μg/mL,纯度为1.87,蛋白质含量为0.007μg/mL质粒DNA,未检测到RNA、抗生素残留。此工艺避免使用动物源性酶类及有毒试剂,有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可实现药剂水平质粒DNA的规模制备。     

超高压处理对大肠杆菌DH5α质粒DNA的影响

文章研究了超高压处理对大肠杆菌DH5α菌株质粒pMD-18DNA的影响.大肠杆菌DH5α在不同的压力下于25 ℃处理15 min后,提取其质粒pMD-18DNA,检测质粒在260 nm和280 nm处的吸光度得到其纯度,并进行了琼脂糖凝胶电泳.实验发现:大肠杆菌DH5α质粒pMD-18DNA经100 MPa、200 MPa处理后其A260、A280与未经高压处理样相比吸光度下降;而经300 MPa、400 MPa和500 MPa处理后其吸光度与未经高压处理样相比吸光度上升.通过琼脂糖凝胶电泳分析,大肠杆菌DH5α质粒DNA经高压(300 MPa、400 MPa和500 MPa)后条带增多.实验结果表明超高压处理影响了质粒DNA的结构.     

质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

质粒DNA(plasmid DNA)是最常用的基因工程和基因疫苗载体,近年来在生物医学和环境科学等领域得到了广泛应用。质粒DNA纯化是分子生物学研究中常用的实验技术,纳米磁性粒子等固相载体技术和色谱技术优化了DNA纯化方法。对大肠杆菌质粒DNA常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进行综述,为质粒DNA的应用研究提供支持。     

大豆自花授粉后外源DNA导入技术的验证

以花生DNA为供体,大豆为受体,在大豆自花授粉后,采用液滴法和注射法导入花生DNA,在受体大豆植株后代中获得了多种变异类型。为探讨外源DNA 导入技术的可靠性,将具有卡那霉素抗性基因的质粒pCaMVneo 用同法导入大豆。所收获的种子发芽后培养于一定浓度的卡那霉素溶液中,其中部分植株对卡那霉素表现抗性,可继续生长发育。分株提取这些植株的DNA,以质粒DNA 为探针,进行斑点杂交.供试的14个植株中出现了13个阳性斑。实验结果证明质粒DNA 已整合到大豆基因组中并获表达,从而间接地证实了授粉后通过花粉管通道导入外源DNA 的技术是可靠的。     

两种盐对质粒DNA提取的影响

随着基因治疗及基因疫苗的不断发展,质粒的需求量迅速增加。通过以pcDNA3为目的产物,考察了在其提取过程中硫酸铵和氯化钙的加入对pcDNA3收率的影响和对杂质的去除效果。实验发现:硫酸铵和氯化钙的加入都可以明显降低质粒提取液中蛋白质、RNA杂质的含量;但是氯化钙在降低蛋白质和RNA含量的同时也降低了质粒DNA的收率。硫酸铵是去除蛋白质、RNA杂质的良好试剂,同时能够保持较高的质粒DNA收率。当质粒提取液中硫酸铵浓度加入到2.5M时,质粒的纯化因子可达到10.2,而收率在90%以上。     

利用反向PCR鉴定沼泽红假单胞菌中野生质粒

为准确研究沼泽红假单胞菌的野生质粒及其携带的基因信息,在常规碱裂解法基础上,对沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris AS1.2352中野生质粒提取方法进行了优化,优化方法具有易操作、耗时少、纯度高等特点,所得质粒DNA纯度和质量均满足进一步分子操作的需要.同时,利用反向PCR技术鉴定该野生质粒,并结合生物信息学方法对其进行分析,比传统的质粒丢失法验证和考察质粒更为省时、可靠和直观.证明菌株携带4个野生质粒,其中2.3 kb的质粒序列与Escherichia coli pEC157 Rom-like protein gene有97.8%的同源性,推测1885~1887碱基为复制起点.     

两种质粒DNA纯化方法的比较

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,在基因构建中常被用作基因的载体,实验中经常使用碱裂解法提取质粒.本实验对应用经典纯化方法和离心柱吸附纯化方法提取的质粒进行了对比,结果表明,离心柱吸附纯化方法提取质粒更快捷、更高效,是质粒提取的最理想方法.