一种高效安全提取质粒DNA方法的建立

在碱裂解法提取质粒DNA的基础上做了改进,将NaOH浓度从0.20 mol/L降低为0.10 mol/L,使得超螺旋DNA的得率进一步提高.采用silica法纯化质粒DNA,避免了使用有毒性和挥发性气味的饱和酚和氯仿,使得操作更安全简单.电泳结果表明,提取的质粒DNA质量好,得率高,并且可以直接进行下一步的酶切、连接及转化等实验.同时,该方法中使用的硅胶可以回收再生进行重复利用,节省了实验费用.     

不同方法提取鳗鲡病原茵DNA模板的差异分析

利用吸光值、琼脂糖电泳及PCR差异扩增等指标,对酚一氯仿法、水煮法、碱裂解法3种方法制备的鳗鲡病原菌DNA模板进行了差异分析．结果表明：1）不同方法提取的病原菌模板DNA的浓度、纯度及分子质量大小存在差异,但以这3种方法提取的病原菌DNA为模板,均能成功扩增到细菌16SrD．NA和外膜蛋白的保守序列．其中,酚一氯仿提取的模板DNA浓度较低、纯度较高;水煮法和碱裂解法提取的模板DNA浓度较高、纯度较低．2）电泳显示,3种方法获得的模板DNA扩增出的16SrDNA保守序列条带均一,没有显著差异,但在外膜蛋白保守序列的扩增中却因菌种和模板提取方法的不同而存在差异．     

农杆菌质粒DNA高效提取方法研究

以EHA105菌株为实验材料,通过优化质粒扩增条件、加大菌液使用量、改良提取纯化过程中所用试剂等,简化了操作流程,给出了一种高效提取农杆菌中质粒DNA的方法。结果表明,选择LB＋KANA为培养基、抗生素质量浓度为50 mg/L,细菌培养至OD600=0.634～0.714时,以5 mL/次用量取菌液裂解;以改进方法提取试剂,得率与常规方法相当。该方法在满足PCR检测条件的前提下既减少了酚、氯仿等有毒试剂的用量,又省时、经济、方便,为植物转基因工程中目的物DNA的检测提供了技术支持。     

体外培养瘤胃微生物总DNA的提取与纯化

主要目的是寻找一种能最大限度获取所有类型的瘤胃微生物大片段DNA的提取方法,为后期分子生物学技术研究瘤胃微生物奠定基础。采用液氮冻融+溶菌酶+CTAB和SDS相结合的方法处理瘤胃样品并充分破壁,再采用酚/氯仿/异戊醇抽提、异丙醇沉淀获得DNA粗提物,经过试剂盒纯化后得到瘤胃微生物DNA样品。经特异性引物PCR检测,本方法所提取的DNA包含细菌、古细菌、真菌及原虫四类微生物信息。因此,采用该方法提取的DNA可用于后期实时定量PCR或DGGE等研究。     

一种快速的重组农杆菌PCR鉴定方法

建立一种快速的重组农杆菌PCR扩增鉴定方法,采用煮沸法处理重组农杆菌,使农杆菌高温裂解,释放质粒DNA,直接进行PCR扩增反应,检测目的基因片段.结果表明,重组质粒PCR扩增效果较好,目标条带较为明显.通过煮沸重组农杆菌,进行PCR扩增反应鉴定质粒DNA,不仅实验操作简单安全,缩短实验时间,并且避免了酚、氯仿试剂在提取质粒DNA过程中的残留对后续分子鉴定质量的影响.     

从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究

从血液中提取基因组DNA的传统方法是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀．CTAB法提取基因组DNA多应用于植物和微生物,从全血中提取基因组DNA报道甚少．采用改良的CTAB法从全血中提取基因组DNA,并以传统方法和TAKARA Blood Genome DNA Extraction Kit作对照．结果表明：CTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到1．8～2．0,可以满足PCR扩增和限制酶切等实验的要求．     

用改进的酚-氯仿法提取榕小蜂基因组DNA及SRAP分析

以传粉榕小蜂为材料,用改进的酚-氯仿法对不同保存条件下的样品提取基因组DNA,并进行分光光度、琼脂糖凝胶电泳、SRAP扩增等方法的鉴定.结果表明:改进的酚-氯仿法均可从4种保存条件下的样品中提取出DNA,新鲜样品和体积分数95％乙醇固定样品提取效果比其他2组提取效果好.选择体积分数95％乙醇固定所提取的DNA为模板进行...     

北川白山羊血液中总DNA的不同提取条件对PCR的影响

对35只北川白山羊血液中总DNA提取并根据普通牛已知的κ-CN基因序列设计一对引物进行扩增,对影响PCR反应结果的因素进行了比较分析。结果表明:蛋白酶K终浓度为0.05 mg/mL,饱和酚—氯仿抽提3次、每次30 min,采用乙醇沉淀DNA时,DNA产量最低,PCR反应无特异条带;蛋白酶K终浓度为0.1 mg/mL,饱和酚-氯仿抽提1次、每次5 min,分别采用超速离心和乙醇沉淀DNA时,DNA产量最高,PCR反应有特异条带(350 bp),但前者出现引物二聚体,故作PCR反应时选择后者沉淀最佳。     

从石蜡包埋的皮肤组织中提取核酸的两种脱蜡方法比较

探讨从石蜡组织中提取核酸的简便、实用方法,比较两种脱蜡方法对DNA质量的影响.取收集的20例包埋好的银屑病皮损组织,分别用二甲苯和TES溶液脱蜡、酚-氯仿提取,然后检测DNA的浓度及纯度,并用PCR扩增方法检测哪种脱蜡方法对提取DNA更有优势.结果表明,用TES溶液脱蜡提取DNA的D260/D280=1.6～1.8的比例为60%,而二甲苯脱蜡的比例为35%.从实用、快速和经济的角度综合考虑,TES溶液脱蜡、酚-氯仿提取是值得推荐的石蜡组织DNA提取方法.     

一种简易的昆虫基因组DNA提取方法

报道了一种改进的昆虫基因组DNA 的提取方法.结果表明,该方法可在常温条件下,对多种昆虫及人体组织进行酚/氯仿抽提,DNA 得率较高,OD260/280 的值在1.6～1.9 之间.     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

An easy-to-use site-directed mutagenesis method with a designed restriction site for convenient and reliable mutant screening

Site-directed mutagenesis (SDM) has been a very important method to probe the function-structure relationship of proteins. In this study, we introduced an easy-to-use, polymerase chain reaction (PCR)-based SDM method for double-stranded plasmid DNA, with a designed restriction site to ensure simple and efficient mutant screening. The DNA sequence to be mutated was first translated into amino acid sequence and then the amino acid sequence was reversely translated into DNA sequence with degenerate codons, resulting in a large number of sequences with silent mutations, which contained various restriction endonuclease (RE) sites. Certain mutated sequence with an appropriate RE site was selected as the target DNA sequence for designing a pair of mutation primers to amplify the full-length plasmid via inverse PCR. The amplified product was 5′-phosphorylated, circularized, and transformed into an Escherichia coli host. The transformants were screened by digesting with the designed RE. This protocol uses only one pair of primers and only one PCR is conducted, without the need for hybridization with hazardous isotope for mutant screening or subcloning step.     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

硅胶破碎法抽提真菌染色体DNA

在进行基因组步行PCR克隆真菌木聚糖酶基因的研究中,探索并建立了一套可在普通分子生物学实验室采用的高得率、高质量真菌染色体DNA的抽提方法.采用液氮研磨和硅胶破碎相结合提高染色体DNA得率,采用亚精胺法纯化提高DNA的纯度.抽提的染色体DNA用琼脂糖凝胶电泳、限制酶切、PCR反应及紫外吸收光谱等方法进行了鉴定,结果显示此方法可以获得分子量大、样品纯的染色体DNA,可有效地用于PCR扩增,并能被限制酶有效地消化.     

一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法

依据快检缓冲液筛选重组子克隆的方法,结合碱裂解法提取质粒DNA的原理,经过试验摸索,应用了快检缓冲液直接裂解菌液,电泳后筛选重组质粒的方法,避免了提取质粒鉴定等繁琐步骤,其结果与菌液PCR、质粒酶切鉴定结果一致,可快速筛选出重组克隆.     

鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用

目的建立小鼠鼠痘病毒PCR检测方法,并应用于鼠源性生物制品的检测。方法根据鼠痘病毒基因组序列中保守的crmD片段设计一对引物,建立鼠痘病毒PCR检测方法;人工感染20只小鼠,对其肝、脾、肾、脚掌及血液采用该方法进行检测;提取鼠源性生物制品中DNA,采用该方法检测其是否存在鼠痘病毒。结果该方法可以检测到稀释至10-5感染鼠痘病毒的细胞,在BHK21细胞和牛痘病毒中均未扩增出相应片段;该方法可检测出人工感染小鼠不同组织中病毒DNA;在鼠源性生物制品中未检测出鼠痘病毒DNA。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于染病动物组织及鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测。     

人B淋巴细胞刺激因子的真核表达以及表达条件的筛选

采用基因克隆、重组等方法，将人B淋巴细胞刺激因子（hsBLyS）基因从人胎盘cDNA文库中克隆出来，测序鉴定后得组构建成真核表达载体pcDNA3．1( )hsBLyS，然后用磷酸钙法和脂质体法分别转染真核宿主细胞COS－7，并在其中表达48h、36h、72h、96h；表达细胞经超声处理后离心，上清进行SDS－PAGE鉴定，结果表明：对于hsBLyS来说，磷酸钙法比脂质体法转染效果好，而且对于磷酸钙法，表达量是72h达到最高。     

高致病性猪链球菌双组分系统Ihk/Irr双基因缺失突变株的构建

目的构建Ⅱ型猪链球菌05ZYH33菌株双组分系统Ihk/Irr的双基因缺失突变株.方法首先对双组分系统Ihk/Irr基因进行序列分析;选取Ihk/Irr基因的相关片段克隆至p ET30a表达载体,进行可溶表达并注射家兔制备抗体;分别将ihk基因上游irr基因下游各1 kb的片段扩增,将两个片段连接起来;克隆至温敏型p JRS233的穿梭质粒中;利用两步同源重组法获得突变体;分别提取突变株的基因组DNA,RNA及菌体总蛋白,利用PCR,RT-PCR,Western-blot方法验证突变体.结果成功制备了双组分系统Ihk/Irr可溶性表达的蛋白,成功构建了重组的温敏型ikr-p JRS233重组质粒,成功将重组质粒转入猪链球菌05ZYH33中并获得突变株,基因组PCR,RTPCR及Western-blot分别证实了双组分系统Ihk/Irr双基因被成功敲除.结论成功构建重组温敏型的穿梭质粒,导入到猪链球菌05ZYH33菌株中经两步同源重组获得突变株,在基因组DNA,RNA及蛋白水平上验证了双组分系统Ihk/Irr双基因缺失株的成功构建.     

鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法的建立及应用

目的建立鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法,并应用于鸡胚及禽源性生物制品的检测。方法根据鸡胚致死孤儿病毒长纤突保守序列分别设计3对引物,优化并建立鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法;分别采用该方法对SPF鸡胚和流感疫苗、麻疹疫苗进行检测。结果建立的方法可检测到10-9稀释的病毒DNA;该方法与鼠腺病毒及猴腺病毒无交叉反应;在SPF鸡胚及禽源性生物制品中应用该方法均未检出病毒。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于禽源性生物制品中鸡胚致死孤儿病毒的检测。     

鸡白痢沙门氏菌直接-多重PCR检测体系的建立

通过对鸡白痢沙门氏菌毒力质粒pSPUV上入侵质粒抗原J蛋白和质粒共转移调控因子的编码基因ipaJ和traJ的序列分析,在特异区域设计PCR引物,经沙门氏菌属不同种及常见肠道致病菌的交叉验证,筛选出三对鸡白痢沙门氏菌特异检测引物ipaJ-417、traJ-387、traJ-476.并且调试出一种利用两种DNA聚合酶的直接三重PCR检测体系:invA-211/traJ-387/16S-495,可以对鸡白痢沙门氏菌进行快速准确的鉴定.