鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用

目的建立小鼠鼠痘病毒PCR检测方法,并应用于鼠源性生物制品的检测。方法根据鼠痘病毒基因组序列中保守的crmD片段设计一对引物,建立鼠痘病毒PCR检测方法;人工感染20只小鼠,对其肝、脾、肾、脚掌及血液采用该方法进行检测;提取鼠源性生物制品中DNA,采用该方法检测其是否存在鼠痘病毒。结果该方法可以检测到稀释至10-5感染鼠痘病毒的细胞,在BHK21细胞和牛痘病毒中均未扩增出相应片段;该方法可检测出人工感染小鼠不同组织中病毒DNA;在鼠源性生物制品中未检测出鼠痘病毒DNA。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于染病动物组织及鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测。     

3Rs原则的应用实例——用鸡胚肝细胞替代鸡肾细胞培养禽腺病毒

在动物实验中利用减少 (reduction)、替代 (replacement)和优化 (refinement)的 3Rs原则 ,是执行实验动物福利的重要体现。利用SPF鸡胚肝细胞培养禽腺病毒 ,用于制备诊断抗原和病毒研究 ,取代用SPF鸡肾细胞培养禽腺病毒 ,通过观察细胞病变和测定抗原滴度分析比较 ,前者完全可以替代后者制备禽腺病毒诊断抗原 ,是利用 3Rs原则的具体实践。尽可能利用可替代实验动物的替代物 ,通过细胞组织培养的方法取代活体动物进行实验 ,将动物的痛苦减至最低     

小鼠腺病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。     

SPF鸡微生物质量控制标准与监测技术

SPF鸡及鸡胚被大量用于人和兽用生物制品的生产基质和质量检定材料,在农业科学、医学科学和生物制品等领域的研究、生产、检定工作中有非常重要的作用。本文总结了SPF鸡及鸡胚的微生物质量控制标准、质量监测技术,以及我国SPF鸡培育和产业发展概况。     

SPF种鸡群的培育

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所利用中国 澳大利亚合作项目“SPF禽饲养预保种设施” ,将京白鸡BWE品系经疫病净化 ,生物学敏感性实验和选育培育试验等技术 ,用定期进行疫病监测并淘汰阳性鸡的方法 ,净化特定的病原和抗体。得出净化了禽白血病病毒等 18种特定病原和抗体 ,对新城疫病毒等 9种病原微生物敏感 ,建立了遗传性能稳定和生产性能良好的具有 7个家系的BWEL SPF种鸡群。已生产SPF种蛋5 0余万枚 ,SPF鸡近 2万只 ,大力支援了科学研究和生产和生物制品生产。该项目的完成是在国内首次采用国内普通鸡群 (京白鸡 )为原材料 ,经净…     

鸡副粘病毒病的病毒特性和基因型研究及疫病防制

用ＳＰＦ鸡胚分别从不同患病鸡群中分离到４株病毒,经病毒学鉴定,该病毒为禽副粘病毒Ｉ型。根据在疫毒力的国际判定标准测定,４株病毒均属于新城商年;人工感染７１周龄ＳＰＦ鸡均１００％发病致死;应用１株鹅副粘病毒制备的具有对禽副粘病毒Ｉ型共同的群特异性单抗各仅对鹅副粘病毒毒株、鸡副粘病毒毒株呈阳性反应,而对新城疫Ｆ４８Ｅ８,Ｌａｓｏｔａ等毒株不发生反应的特异性单克隆抗体;应用ＲＴ－ＰＣＲ技术对禽副粘病毒Ｉ     

雏鹅新型病毒性肠炎病原快速检测技术的建立及应用

根据小鹅瘟病毒(GPV)和鹅源禽腺病毒(FAV)基因组序列特征分别设计了各自的PCR引物,经对反应条件的优化建立了能同时检测两种病毒的二重PCR方法．该法能从雏鹅新型病毒性肠炎和小鹅瘟疫苗株以及分离的鹅源腺病毒蚀斑克隆株分别扩增出相应的特异性产物,而对其它常见鹅病的病原及正常鹅胚肝组织的扩增结果均为阴性;对来自广西不同地方的36份临床病例样品的检测发现,其中具有雏鹅新型病毒性肠炎典型病变的22份样品均可检出GPV和FAV两种病毒．其它的有4份只检出GPV,3份只检出FAV;12份健康雏鹅肝组织中仅有一份检测到GPV;健康成鹅泄殖腔中GPV和FAV的检出率分别达44．29％、37．14％二者都有的占1．43％．结果表明,雏鹅新型病毒性肠炎的病原可能包括GPV和FAV两种病毒;建立的PCR诊断技术具有快速、敏感、特异的特点,可用于该病征的临床快速鉴别诊断以及流行病学的调查研究．     

Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索

将Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株进行纯粹检验；以100ELD50 0.2mL/枚(含病毒3.0×105个拷贝)剂量经鸡胚尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,每隔12h观察并采集鸡胚胚体和尿囊液样本,运用自行建立的检测DHV-1的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法检测MY株弱毒的鸡胚增殖规律.结果表明,该毒种符合...     

21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的PCR检测

为检测某鸡场21日龄鸡胚金黄色葡萄球菌感染情况, 针对其特有的耐热核酸酶基因(Nuc)设计并合成1对引物进行PCR扩增, 建立特异性检测金黄色葡萄球菌的PCR方法. 对18个21日龄鸡胚培养、分离, 获得18株疑似金黄色葡萄球菌菌落. 用建立的PCR方法对18份疑似样品进行扩增获得4份金黄色葡萄球菌的阳性扩增, 证实该鸡群21日龄鸡胚中金黄色葡萄球菌的感染率为22%(4/18). 本文中基于Nuc基因建立的PCR检测方法是检测鸡胚中金黄色葡萄球菌快速、特异的分子生物学方法.     

无特定病原(SPF)鸡工艺设计中的几个技术问题初探

<正> 无特定病原体(SPF)鸡胚,可供病毒学、胚胎学及毒理学研究,并可生产和检定多种人与动物的生物制品,如制备小儿麻疹疫苗、黄热病疫苗、狂犬病疫苗的原材料,制备畜禽用的新城疫、马立克氏病,传染性支气管炎,禽痘、犬瘟热、鸭肝炎、多发性粘液瘤等疫苗的原材料。在国民经济中占有特定位置,不仅能保护人民身体健康和发展畜牧业生产,还可提高我国的生物科研水平及生物制品质量。     

如何提高SPF种蛋的孵化率

SPF种蛋是研制和鉴定人、畜、禽等多种生物制品的高标准材料。SPF鸡的遗传、饲养管理,种蛋的存储、运 输,温度、湿度和通风等孵化条件在很大程度上影响其孵化率,改善上述因素能提高SPF种蛋的孵化率,降低畜禽 诊断和兽医生物制品的生产成本。     

线粒体基因种属鉴定复合扩增体系

针对cyt b基因和ND6基因序列,设计两对引物,以14种常见动物（包括人）生物性检材为对象进行PCR扩增,产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、硝酸银染色进行分析。结果证明,两条电泳条带者为人样本,分别是cyt b基因片段（358 bp）和ND6基因片段（181 bp）;一条电泳条带者为动物来源,是358 bp cyt b基因片段。在37.5μL PCR反应体系中最小检出模板量为0.25 pg基因组DNA。检材在4℃、室温和37℃温度下,经过4个月后均可获得正确的种属区分。高度潮湿环境中放置50 d的检材、形成于水泥地面、墙面、泥土等基质上的血痕,本方法可得到正确区分。由此建立的种属鉴定的线粒体基因复合扩增体系,其检测片段短、灵敏度高、操作简易,适合法医学上微量、降解、陈旧检材的种属判定。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测大豆SRAP标记

以大豆为试验材料,提取了大豆的基因组DNA,对大豆进行SRAP-PCR扩增,并对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,最后硝酸银染色。建立了一种行之有效、简便快捷的应用于大豆SRAP标记的PAGE银染检测方法。     

牛肉及其制品中肉类掺假的荧光PCR鉴别体系优化

根据可能用于牛肉及其制品掺假的肉类原料(猪肉、鸡肉和鸭肉),设计了4对引物和探针.经过测试其具有良好的特异性后,对影响各自聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的5个影响因素包括Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶活、dNTPs浓度、引物和探针浓度以及模板DNA用量等进行了优化,确定了最佳的PCR扩增体系.同时,根据优化后的结果,对特异性进行进一步的测试,并使用建立的优化荧光PCR鉴别体系对混合样品和市售样品进行检测,确定整体检出限为0.1%(质量分数),并证明该鉴别体系的实际应用价值.     

传染性支气管炎病毒血凝抗原的制备

目的利用磷脂酶C处理，制备传染性支气管炎病毒（IBV）血凝抗原。方法将IBV接种9日龄SPF鸡胚，48h后收获尿囊液，经过高速离心浓缩，利用胰酶、产气荚膜梭状芽孢杆菌培养液（含磷脂酶C）处理后，进行常规血凝和血凝抑制试验。结果经过胰酶处理的IBV具有非常强的非特异性。而经过磷脂酶C处理的IBV，该凝集作用可被特异的IBV抗血清所抑制，而不能被ILTV、NDV、Adeno-1和Adeno-3，APIV、AIV、IBDV、HP、MS和MG等抗血清所抑制。结论磷脂酶C处理的IBV，可以用于血凝抑制试验。     

拉布拉多犬与金毛猎犬毛色基因MC1R(R306ter)与TYRP1(Q331ter)SNP位点的检测

目的建立犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法。方法采用PCR/测序的方法,对19只拉布拉多犬和15只金毛猎犬的MC1R基因c.C916T SNP位点及TYRP1基因c.C991T SNP位点的多态性进行检测,根据MC1R和TYRP1的多态性对犬的毛色基因型进行分析。结果 PCR/测序法能够对TYRP1基因c.C991T SNP位点进行明确和有效的检测。但MC1R基因c.C916T SNP位点的测序结果出现了特殊峰,经克隆/测序法确认该特殊峰型为杂合性SNP位点。毛色基因型分析表明,金毛猎犬的毛色基因型皆为纯合的eeBB(15只),未见其他基因型。拉布拉多犬的毛色基因型分别为:黑色犬EeBB(6只)、EeBb(2只);黄色犬eeBB(9只)、eeBb(2只)。未发现其他如EEBB和EEBb(黑色)、eebb(黄色)的毛色基因型。另外,拉布拉多犬样本中没有巧克力色犬,也未检测出其相应的Eebb和EEbb基因型。结论本研究成功建立了犬毛色基因MC1R R306ter(c.C916T)与TYRP1 Q331ter(c.C991T)SNP位点的检测方法,为分析毛色基因型与导盲犬培训成功率之间的相关性提供了前期工作基础。     

SPF鸡舍屏障设施最优化运行的自动化改装及研究

SPF鸡舍的净化质量和节能问题一直是困扰SPF鸡生产领域的难题,通过对鸡舍屏障设施自动化改装和研究,使达到净化指标的屏障设施更优化、更节能。     

快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的5′端非编码区设计一对引物和一条TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了特异性检测HCLV的荧光定量RT-PCR方法．结果表明：该方法检测的最低拷贝数为45拷贝／μL,灵敏度比普通PCR方法高10^4倍,在较广的范围内（4．5×10^1-4．5×10^6拷贝／μL）有良好的线性关系（r=0．994）;分别以乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、副猪嗜血杆菌、牛病毒性腹泻,黏膜病病毒作为模板进行TaqMan RT-PCR扩增,未出现阳性信号：4个不同浓度标准品组内试验变异系数为1．90％～5．82％,组间试验变异系数为4．02％～5．69％：HCLV3个cDNA样本组内试验变异系数为3．72％～4．93％;组间试验变异系数为2．99％～4．02％．该方法具有很好的灵敏性、特异性及稳定性,能够快速准确定量检测HCLV,为HCLV疫苗的研制、猪瘟病毒分子生物学等方面研究提供了一种快捷有效的工具．     

DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响

国内外非常重视转基因产品的检测工作,主要依赖于DNA的PCR方法进行检测,其检测结果可靠、稳定、灵敏度较高。尤其在转基因产品的定值实验中,荧光定量PCR的应用起到重要的作用,但是DNA的质量是保证荧光定量PCR定值准确的关键。实验以100%的克螟稻为材料,用CTAB法、商品化的Promega、Qiagen以及TIANGEN提取试剂盒,分别提取克螟稻基因组DNA,经过核酸蛋白分析仪初步测定浓度、纯度以及离子浓度后,分别以水稻内源基因PLD和克螟稻特异性转化体引物及探针实施荧光定量PCR实验,以100%克螟稻为盲样实施定值,来确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的DNA提取方法,最终确定Qiagen和TIANGEN提取试剂盒满足荧光定量PCR对100%的克螟稻标准物质定值实验的要求。