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《实验动物科学》2016,(2)
目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。 相似文献
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目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。 相似文献
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《实验动物科学》2017,(3)
目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。 相似文献
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摘要: 目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCR 方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA 基因设计特异性引物和探针,构建含有HA 基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCR 检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCR 检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN 线性范围达10 个数量级( 100—109 拷贝) ,最低检测限度为4 拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR 和测序进行确证。整个检测过程可在2 h 内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB 探针实时荧光定量PCR 方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。 相似文献
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摘要: 目的 建立猫细小病毒 PCR 检测方法,应用于猫临床样本中 FPV 的快速检测。方法 根据已发表的 FPV VP2 基因序列设计合成引物,并以此建立 FPV 的 PCR 检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。 用建立的方法对 33 份猫临床样品进行检测。结果 建立的 FPV PCR 检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠 状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为 5lgTCID50 / mL,相应的 DNA 模板浓度为 4. 9 × 102 拷贝/μL;FPV DNA 在 - 30℃冰箱放置 12 个月仍可检测出目的条带。应用 该方法从 33 份猫临床样本中检测出 21 份 FPV 核酸阳性。结论 建立的 FPV PCR 检测方法具有特异、敏感及稳定 的特点,适合于临床 FPV 的感染检测。 相似文献
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为了确定致羔羊脑炎粪肠球菌在人工感染小鼠体内的分布规律,本研究采用粪肠球菌人工培养物腹腔注射小鼠,无菌采集死亡或濒临死亡小鼠脏器,利用已建立的PCR技术对人工感染肠球菌小鼠主要脏器进行检测,结果显示在受检的6种组织中,即肝、脾、心、脑、肾均能扩增出与预计大小112bp一致的粪肠球菌的DNA阳性条带。与细菌分离结果一致。 相似文献
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《石河子大学学报(自然科学版)》2010,(6)
为进一步研究单核细胞增多性李氏杆菌的致病机制,培养浓度为9×109 cfu/mL单核细胞增多性李氏杆菌,采用Karber法测得该菌对小鼠的LD50为2.85×108 cfu/mL。由此建立小鼠模型,然后人工腹腔感染小鼠30只,分别在感染后2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h定期剖杀感染小鼠,取其脏器,采用PCR方法、分离培养及病理组织学方法,对感染模型小鼠体内的单核细胞增多性李氏杆菌动态分布及各器官的病理组织学变化进行初步研究。结果显示:感染2h,脾、肝、心血组织中均可检测到单核增多性李氏杆菌DNA,同时从上述脏器也可分离到单核增多性李氏杆菌;感染6h,大脑中可检测到单核增多性李氏杆菌DNA,并在感染后72h可分离到该细菌;感染4~6h,脾、心血、肝脑即开始出现病理变化和组织学变化。 相似文献
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目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109~104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。 相似文献
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建立了基于锁式探针的超分支滚环扩增检测嗜水气单胞菌的新方法。根据嗜水气单胞菌ARE基因上的一段高保守基因序列,设计锁式探针和对应的扩增引物,并优化了反应条件。探针在T4 DNA 连接酶作用下,16 ℃连接1 h、63 ℃扩增1 h,其扩增产物电泳后得到明显条带。在8种水产养殖病原菌中,只有嗜水气单胞菌可以特异性检出,并且特异性良好,灵敏度(1.0×103 cfu/mL)高于免疫法以及常规的PCR法。对嗜水气单胞菌人工感染的美洲鳗鲡肌肉样品进行检测,发现条带清晰可见。该方法的反应过程是在恒温条件下进行,不需要PCR 仪,此外,样品处理过程简单,应用水煮法即可进行。 相似文献
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单引物PCR扩增DNA指纹图谱的稳定性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
以人胶原蛋白基因下游一段DNA的互补序列设计引物,对人染色体DNA进行单引物PCR扩增,在低温退火的条件下,这种引物与DNA模板的一处完全配对,并且可以随机地结合在其他一些位置上。由此进行单引物PCR扩增,它们的扩增产物形成了稳定的引物-模板特异的DNA指纹图谱。本文所建立的单引物PCR扩增技术在类似的研究中均可获得稳定的实验结果,具有一定的应用价值。 相似文献
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草鱼基因组随机扩增多态性引物及多态性位点的筛选 总被引:4,自引:0,他引:4
为了建立草鱼基因组DNA多态性分析的指标体系,应用RAPD技术,从180条10碱基随机引物中筛选出了31条能扩增出多态性DNA片段的引物。用这31条多态性引物共扩增出了327条重复性好、带型清晰、分辨率高的谱带。扩增产物的片段大小范围在400—2000bp之间。单一引物扩增条带为5—14条。用这些多态性引物在草鱼基因组DNA中检测到了93个多态性位点,并对这些多态性位点上的等位基因频率进行了统计分析。这31条多态性引物和所检测到的93个多态性位点初步为草鱼基因组的多态性分析提供了可靠的分析指标体系。 相似文献
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土壤细菌基因资源的直接分离——16S核糖体RNA基因模式 总被引:3,自引:0,他引:3
细菌遗传资源的开发利用必须先分离纯培养物,但绝大多数环境细菌无法人工培养。由于基因工程技术能直接利用基因元件,为绕过人工培养的困难,我们以细菌16S核糖体RNA基因为模式,建立了直接从土壤中分离基因元件的方法,该方法包括直接从土壤中分离DNA,PCR扩增基因和PCR产物克隆等步骤,为直接收集,利用土壤细菌遗传资源奠定了基础。 相似文献
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DNA提取是拟南芥突变体筛选与鉴定中的关键环节.结合拟南芥突变体鉴定特点和DNA提取特点,对传统SDS法进行改良,摸索出一种简易、快速且经济的DNA提取方法,并将其应用到突变体的批量筛选与鉴定中.使用该方法可在常温下利用10mg左右拟南芥叶片,以少量试剂,通过简单的研磨、离心、沉降和干燥等步骤便能快速制备用于PCR检测的DNA模板.采用本方法个人提取单个样品DNA仅需15min左右,每小时可提取48个DNA样品.研究采用该方法提取了一批待鉴定拟南芥突变体的DNA样品,利用三引物法对其进行PCR检测,结果表明DNA样品浓度高,DNA扩增成功率高达100%,且目的条带清晰,说明该方法在拟南芥突变体的筛选和鉴定上是适用且高效的,可广泛应用于实验室突变体库的建立. 相似文献